nhiễm tự nhiên
* Nguyên tắc: Gia súc nhiễm bệnh LMLM sẽ sản sinh kháng thể kháng protein không cấu trúc (3ABC), trong khi gia súc khỏe mạnh, chưa bao giờ nhiễm bệnh được tiêm phòng vắc xin LMLM tinh khiết không có kháng thể này.
* Nguyên liệu: Bộ KIT chẩn đoán CHEKIT - FMD - 3ABC ELISA (mã FBT139T) do phòng thí nghiệm IDEXX Thụy Sỹ cung cấp và các dụng cụ thông thường được sử dụng trong phòng thí nghiệm được tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất, các bước tiến hành được tóm tắt như sau:
- Đĩa ELISA được phủ kháng nguyên 3ABC của vi rút LMLM, kháng nguyên có độ tinh khiết cao được sản xuất bằng phương pháp tái tổ hợp;
- Pha loãng huyết thanh với tỷ lệ 1: 100;
+ Mẫu huyết thanh trâu bò cần chẩn đoán, huyết thanh đối chứng dương, huyết thanh đối chứng âm chuẩn được pha loãng theo tỷ lệ 1/100 bằng dung dịch CHEKIT-FMD-3ABC-Sample-Diluent.
+ Cho 100 µl/giếng vào 96 giếng theo sơ đồ ở trang sau.
+ Ủ ở 370C trong 60 phút. Phức hợp kháng nguyên 3ABC - kháng thể kháng 3ABC sẽ được tạo thành nếu trong huyết thanh có kháng thể kháng 3ABC. Rửa bằng dung dịch CHEKIT-Washing với lượng 300 µl/ giếng, rửa 3 lần để loại bỏ phần kháng thể 3ABC thừa.
- Gắn Conjugate, tỷ lệ 1: 200;
+ 55 µl CHEKIT-Anti - IgG-PO-Conjugate + 11 ml CHEKIT - Washing & Dilution - Solution.
+ Cho 100 µl/ giếng, ủ ở 370C trong 60 phút, sau đó rửa 3 lần thấm khô. - Cho cơ chất: Cho 100 µl CHEKIT- Chromogen, ủ ở nhiệt độ phòng 20-30 phút; - Dừng phản ứng: Cho 50 µl Stopping-Slution/giếng để nhiệt độ phòng; - Đọc kết quả phản ứng bằng máy đọc ELISA ở bước sóng 405 nm. - Đánh giá kết quả theo công thức:
Giá trị%(% OD) = ODsaple-ODneg x 100 ODpos- ODneg
Trong đó ODsample = của mẫu xét nghiệm. ODpos = đối chứng (+).
ODneg = đối chứng (-).
Mẫu dương tính khi OD > 30%, mẫu âm tính khi OD < 20%, mẫu nghi ngờ khi 20% < OD < 30%
- Sơ đồ thí nghiệm: + + + + + + + + + + + + A N N 7 7 15 15 23 23 31 31 39 39 B P P 8 8 ... ... ... ... ... ... ... ... C 1 1 ... ... D 2 2 ... ... E 3 3 ... ... F 4 4 ... ... G 5 5 45 45 H 6 6 14 14 22 22 30 30 38 38 46 46 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Ghi chú: (+) : Kháng nguyên; N : Đối chứng âm; P : Đối chứng dương;
Số: 1, 2 ....46 : Mẫu huyết thanh xét nghiệm. 2.4.5.2. Phương pháp ELISA xác định type vi rút LMLM
* Nguyên lý: Kháng nguyên tương ứng sẽ được gắn với kháng thể đặc hiệu cho từng type vi rút đã được hấp phụ lên bề mặt các giếng của đĩa phản ứng, kháng thể tiếp theo sẽ gắn vào kháng nguyên. Mẫu kiểm tra có kháng nguyên tương ứng sẽ được gắn vào các lỗ của đĩa, mẫu kháng nguyên không tương ứng sẽ bị rửa trôi. Mẫu dương tính sẽ kết hợp với conjugate có gắn enzyme, phản ứng chuyển màu sẽ xảy ra khi có sự tham gia của chất xúc tác Substrate/Chromogen.
* Các bước tiến hành
- Xử lý bệnh phẩm: Mẫu bệnh phẩm là biểu mô mụn nước được nghiền trong cối chày sứ với dung dịch BPS 0,04M theo tỷ lệ 1/5, sau đó cho huyễn dịch vào ống nghiệm và ly tâm với tốc độ 3000 vòng/ phút thời gian 30 phút, loại bỏ cặn lấy nước trong. Lặp lại ly tâm 3 lần ta thu được dung dịch vi rút (kháng nguyên).
- Sơ đồ đĩa: Đĩa xét nghiệm gồm 96 lỗ được đánh số hàng ngang theo thứ tự từ 1-12 và hàng dọc từ A-H (08 hàng).
+ Theo hàng dọc, đĩa chia làm hai phần từ A-D và từ E-H tương ứng từng hàng với các serotype O, A, C, Asia-1, mỗi phần có thể xét nghiệm 3 bệnh phẩm.
+ Theo hàng ngang, từ cột 1-4 là các đối chứng kháng nguyên (+) mạnh và kháng nguyên (+) yếu. Cột 5 và 6 là cột BLANK (không tham gia phản ứng). Từ cột 7-12 là các mẫu bệnh phẩm (hai ô một bệnh phẩm). Trên một đĩa ELISA định type vi rút được 6 bệnh phẩm.
- Sơ đồ thí nghiệm: Serotype ĐC (+) mạnh ĐC (+) yếu BLANK Bệnh phẩm 1 Bệnh phẩm 2 Bệnh phẩm 3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A O B A C C D Asia-1 E O F A G C H Asia-1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Bệnh phẩm 4 Bệnh phẩm 5 Bệnh phẩm 6 Bước 1: Gắn đĩa (coating): Kháng thể thỏ kháng vi rút LMLM của các type O, A, C và Asia-1 được pha loãng tỷ lệ 1/500 với dung dịch gắn (dung dịch đệm).
Pha 1 lọ Bicarbonat Natri + 6,6 ml nước khoáng Lavie tinh khiết thành dung dịch buffer.
3 µl kháng thể thỏ kháng FMD type O + 1,5 ml buffer. 3 µl kháng thể thỏ kháng FMD type A + 1,5 ml buffer. 3 µl kháng thể thỏ kháng FMD type C + 1,5 ml buffer. 3 µl kháng thể thỏ kháng FMD type Asia-1 + 1,5 ml buffer.
Cho 50 µl kháng thể thỏ kháng FMD các type trên vào các giếng tương ứng và ủ qua đêm ở 4°C hoặc lắc ủ ở 37°C trong khoảng thời gian 1 giờ. Tiếp theo rửa đĩa 3 lần bằng dung dịch PBS 0,01M.
Bước 2: Cho kháng nguyên ĐC (+) mạnh và kháng nguyên ĐC (+) yếu của từng type O, A, C, Asia-1 và huyễn dịch mẫu bệnh phẩm cần kiểm tra vào các hàng tương ứng đã gắn kháng thể thỏ:
Cột 1-2: Cho 50 µl dung dịch kháng nguyên đối chứng (+) mạnh/giếng. Cột 3-4: Cho 50 µl dung dịch kháng nguyên đối chứng (+) yếu/giếng. Cột 5-6: Cho 50 µl buffer A/giếng.
Lắc ủ ở nhiệt độ 37°C trong 1 giờ, rửa 3 lần thấm khô.
Kháng nguyên đối chứng (+) mạnh và kháng nguyên đối chứng (+) yếu được pha loãng bằng dung dịch đệm A (buffer A) như sau: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Buffer A: 1 lọ PBS + 100 ml nước khoáng Lavie + 50 µl Twee 20 + 1 hoặc 2 giọt Red phenol, kiểm tra pH sao cho PBS 0.04M = 7,2 - 7,6.
Pha kháng nguyên trong ống nhựa.
Độ pha loãng kháng nguyên đối chứng (+) mạnh
các type O, A, C và Asia-1 KN (+) yếu =
1/KN mạnh 1/10 1/5 1/4 1/3 24 µl KN + 216 µl buffer A 48 µl KN + 192 µl buffer A 60 µl KN + 180 µl buffer A 80 µl KN + 160 µl buffer A 24 µl KN + 216 µl buffer A
Bước 3: Gắn kháng thể phát hiện (KT chuột lang): Mỗi giếng nhỏ 50 µl kháng thể chuột lang kháng vi rút LMLM type O, A, C và Asia-1 vào các giếng tương ứng. Mỗi type được pha loãng với dung dịch đệm B. Lắc đều, ủ nhiệt độ 37°C trong 1 giờ, rửa 3 lần bằng dung dịch rửa PBS 0,01M rồi thấm khô.
Pha dung dịch đệm B (Buffer B) = buffer A+0,6g bột sữa. KT type O: 15 µl KT + 1,5 ml Buffer B
KT type A: 15 µl KT + 1,5 ml Buffer B KT type C: 15 µl KT + 1,5 ml Buffer B KT type Asia-1: 15 µl KT + 1,5 ml Buffer B
Bước 4: Gắn Conjugate, tỷ lệ 1/200 mỗi giếng 50 µl 30 µl Conjugate + 6 ml buffer B
Lắc ủ ở nhiệt độ 37°C trong 1 giờ, rửa 3 lần thấm khô (giữ Conjugate thừa để kiểm tra màu).
Bước 5: Cho Subtrate/Chromogen tỷ lệ 1/200 30 µl H2O2 + 6 ml dung dịch ODP.
Mỗi giếng 50 µl, các giếng BLANK trước, giếng phản ứng sau, ủ ở nhiệt độ phòng trong hộp tối từ 10-15 phút.
Bước 6: Dừng phản ứng, cho H2SO4 1,25M mỗi giếng 50 µl/lỗ tham gia phản ứng và cột BLANK.
Bước 7: Đọc kết quả trên máy ELISA, kính lọc 492 nm. Các mẫu kiểm tra có OD > 0,1 được coi là dương tính.
2.4.5.3. Phương pháp ELISA phát hiện kháng thể (Dùng cho một type)
a. Phương pháp định tính.
Bước 1: Gắn kháng thể thỏ kháng vi rút LMLM type cần chẩn đoán (type O) lên đĩa 96 giếng. Tỷ lệ 1/500.
12 µl kháng thể thỏ kháng FMDV type cần chẩn đoán + 60 ml buffer, cho vào mỗi giếng 50 µl, ủ ở 4°C qua đêm.
Sơ đồ phản ứng: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A C++ C++ 1 1 9 9 10 10 11 11 12 12 B C++ C++ 2 2 C C+ C+ 3 3 D C+ C+ 4 4 E C- C- 5 5 F C- C- 6 6 G Ca Ca 7 7 H Ca Ca 8 8 40 40
Ghi chú: C++: Huyết thanh đối chứng (+) mạnh
C+: Huyết thanh đối chứng (+) yếu
C-: Huyết thanh đối chưng (-)
Ca: Buffer A
Mỗi đĩa kiểm tra 40 mẫu Bước 2: Trung hòa
+ Pha loãng kháng thể đối chứng với tỷ lệ 1/16
15 µl C++ +225 µl buffer A
15 µl C+ +225 µl buffer A
15 µl C- +225 µl buffer A
+ Pha loãng huyết thanh kiểm tra, tỷ lệ 1/16
10 µl huyết thanh + 150 µl buffer A, pha trong ống nhựa. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Ủ đĩa nhựa
Cột 1-2: Cho huyết thanh đối chứng (4 ô mỗi loại). 50 µl/giếng
Cột 3-12: Cho 50 µl huyết thanh kiểm tra đã pha loãng (2 ô/mẫu)
Cho 50 µl kháng nguyên đã biết vào tất cả các giếng, ủ ở nhiệt độ 4°C qua đêm. Bước 3: Gắn mầu vào đĩa phản ứng.
Hôm sau rửa đĩa đã gắn kháng thể 3 lần. Chuyển 50 µl/1 ô từ đĩa trung hòa sang đĩa phản ứng. Lắc, ủ ở 37°C trong 1 giờ, rửa 3 lần.
Bước 4: Gắn kháng thể phát hiện, tỷ lệ 1:100
Pha 55 µl kháng thể chuột lang kháng FMDV +5,5 ml buffer B. Cho 50
µl dung dịch này vào từng giếng phản ứng, lắc, ủ ở nhiệt độ 37°C trong 1 giờ,
rửa 3 lần.
Bước 5: Gắn Conjugate, tỷ lệ 1/200.
30 µl Conjugate + 6 ml buffer B, cho 50 µl vào mỗi giếng. Lắc, ủ ở nhiệt độ
37°C trong 40 phút, rửa 3 lần (giữ Conjugate thừa để kiểm tra mầu). Bước 6: Cho Substrate/ Chromogen, tỷ lệ 1/200.
30 µl H2O2 + 6 ml dung dịch ODP,
Cho 50 µl vào các giếng (giếng BLANK trước, giếng kiểm tra sau), ủ ở nhiệt độ phòng trong hộp tối từ 15-30 phút.
Bước 7: Dừng phản ứng
Cho 50 µl H2SO4 1,25M vào từng giếng (BLANK trước, giếng chứa mẫu sau). Đọc kết quả trên máy ELISA chương trình Program number 1 với bước sóng 492 nm.
Giá trị% (% PI) = 100 -
OD mẫu xét nghiệm
x 100 Trung bình OD của Ca
Nếu giá trị: PI < 50% là âm tính PI > 50% là dương tính
b. Phương pháp định lượng - Sơ đồ phản ứng: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A C++ C++ 1 1 3 3 5 5 7 7 9 9 B C++ C++ 1 1 C C+ C+ 1 1 D C+ C+ 1 1 E C- C- 2 2 4 4 6 6 8 8 10 10 F C- C- 2 2 10 10 G Ca Ca 2 2 10 10 H Ca Ca 2 2 10 10
Bước 1: Gắn kháng thể thỏ kháng FMDV lên đĩa nhựa.
Lấy 6 µl kháng thể thỏ kháng FMDV type O + 6 ml dung dịch gắn buffer Cho 50 µl/giếng vào 96 giếng của đĩa ELISA, ủ ở 4°C qua đêm
Bước 2: Trung hòa
Pha loãng kháng thể đối chứng, tỷ lệ 1/16
8 µl (C++, C+, C-) + 20µl buffer A (pha trong ống nhựa). Pha loãng huyết thanh kiểm tra, tỷ lệ 1/8
10 µl huyết thanh + 70 µl bufferA (pha trong ống nhựa) Ủ đĩa nhựa:
C++: Huyết thanh đối chứng (+) mạnh C+ : Huyết thanh đối chứng (+) vừa C-: Huyết thanh đối chứng (-) Ca: Buffer A
Mỗi đĩa kiểm tra 10 mẫu.
Cột 1-2: Cho 30µl kháng thể đối chứng (C++, C+, C-) và Ca vào 4 giếng mỗi loại (Ca =bufferA). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cột 3-12: Cho 30 µl buffer A/giếng vào 96 giếng.
Sau đó chuyển 30 µl huyết thanh kiểm tra vào hàng A và E rồi pha loãng theo cơ số 2 từ hàng A đến D, E đến H. Như vậy huyết thanh kiểm tra lúc này có độ pha loãng là 1/16, 1/32, 1/64, 1/128, 1/256.
Cho 30 µl kháng nguyên chuẩn O1 Manisa pha loãng 1/70 (pha với buffer A)
vào tất cả các giếng. Huyết thanh kiểm tra lúc này có độ pha loãng là 1/16, 1/32,
1/64, 1/128, 1/256
Ủ đĩa qua đêm với nhiệt độ là 4°C Bước 3: Gắn mẫu vào đĩa phản ứng
Hôm sau rửa đĩa đã gắn kháng thể kháng FMDV 3 lần thấm khô. Chuyển 50
µl/giếng trung hòa sang đĩa phản ứng. Lắc, ủ ở 37°C trong 1 giờ, rửa 3 lần. Bước 4: Gắn kháng thể phát hiện, tỷ lệ 1:100
Pha 52 µl kháng thể chuột lang kháng FMDV +5200 buffer B. Cho 50 µl dung
dịch này vào từng giếng phản ứng, lắc, ủ ở nhiệt độ 37°C trong 1 giờ, rửa 3 lần. Bước 5: Gắn Conjugate, tỷ lệ 1/200.
30 µl Conjugate + 6 ml buffer B, cho 50 µl vào mỗi giếng. Lắc, ủ ở nhiệt độ
37°C trong 40 phút, rửa 3 lần (giữ Conjugate thừa để kiểm tra mầu). Bước 6: Cho Substrate/ Chromogen, tỷ lệ 1/200.
30 µl H2O2 + 6 ml dung dịch ODP
Cho 50 µl vào các giếng (giếng BLANK trước, giếng kiểm tra sau), ủ ở nhiệt độ phòng trong hộp tối từ 15-30 phút.
Bước 7: Dừng phản ứng
Cho 50 µl H2SO4 1,25M vào từng giếng (BLANK trước, giếng chứa mẫu sau). Đọc kết quả trên máy ELISA chương trình Program number 1 với bước sóng 492 nm.
2.4.5.4. Phương pháp PCR
RT-PCR là phản ứng chuyển đổi ARN thành ADN rồi nhân bản vùng gene
cần nghiên cứu.
Đối với gene đích ở vùng không mã hóa, sử dụng cặp mồi R1-F1 universal, cho phép nhân gene đặc hiệu với cả 7 type vi rút LMLM. Cặp mồi này có trình tự nucleotide:
Mồi Fmdv-Uni-1F: 5’ GCCTGGTCTTTCCAGGTC 3’ (18 nucleotid)
Cặp mồi Fmdv-Uni-1F-1R được sử dụng để nhân vùng gene không mã hóa 5’UTR từ nguồn khuôn ARN của các chủng type O, A, C và Asia-1, cho sản phẩm ADN có độ dài khoảng 323-328 nuceotide tùy thuộc type vi rút.
Đối với gene đích 1d mã hóa cho VP1, mồi đặc hiệu của cả 3 type chung là đoạn mồi ngược có trình tự:
NK61 (R): 5’ GACATGTCCTCCTGCATCTG 3’
Các mồi xuôi, đặc hiệu cho từng type O, A và Asia-1 có trình tự:
ARS4 (F): 5’ ACCAACCTCCTTGATGTGGCT 3’
AS1-1C505: 5’ TACACTGCTTCTGACGTGGC 3’
NK61 (R): 5’ GACATGTCCTCCTGCATCTG 3’
- Thực hiện phản ứng tổng hợp cADN, sử dụng quy trình thường quy của Bộ
môn Hóa sinh Miễn dịch Bệnh lý, Viện thú y trong đó trizol do hãng Invitrogen (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
(Cat. 15596-26), Random primer (Cat C118A) và Reverse Transcriptase do hãng
Promega cung cấp; hoặc tổng hợp cADN sử dụng Kít tách ARN (Qiagen cat
741060), phản ứng được tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Bộ kít và hóa chất dùng cho phản ứng PCR nhân gene do hãng Invitrogen
cung cấp: Superscrip III/Platinum Taq Mix (5U/ul) Invitrogen Catalog No.12547-
018. Thực hiện phản ứng theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
2.4.6. Phương pháp xử lý số liệu
Tất cả số liệu về kết quả nghiên cứu được sử lý bằng phương pháp thống kê sinh vật học Ms Excel (Tô Cẩm Tú, Trần Văn Diễn, 1992) [30].
Hiệu giá kháng thể của mẫu được tính ở độ pha loãng huyết thanh cao nhất còn có khả năng miễn dịch với vi rút LMLM.
Độ pha loãng huyết thanh theo cơ số 2, tức là: lần 1 là 1/2 tương ứng với (1log2), lần 2 là 1/4 tương ứng với 2log2, lần 3 là 1/8 tương ứng với 3log2, lần 4 là 1/16 tương ứng với 4 log2.
Mẫu huyết thanh sau khi tiêm vắc xin LMLM type O có HGKT ≥ 7 log2 được coi là đạt mức bảo hộ.
Công thức tính tỷ lệ bảo hộ cá thể/tổng đàn.
* Tỷ lệ bảo hộ (%) = Số mẫu đạt HGKT bảo hộ x 100 Tổng số mẫu
Một đàn gia súc nếu có TLBH ≥ 70% thì được coi là được bảo hộ đàn. * Tỷ lệ mẫu có kháng thể (%) = Số mẫu có kháng thể x 100
Số mẫu xét nghiệm
* Tỷ lệ nhiễm vi rút LMLM (%) = Số mẫu dương tính x 100 Số mẫu xét nghiệm
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
Với nội dung của đề tài là nghiên cứu sự lưu hành vi rút LMLM trên đàn trâu, bò và hiệu lực của vắc xin trong công tác phòng chống dịch LMLM tại tỉnh Quảng Ninh, kết quả nghiên cứu được trình bày theo trình tự như sau:
3.1. Tình hình chăn nuôi một số loài gia súc móng chẻ tại Quảng Ninh
Quảng Ninh là tỉnh có mô hình phát triển kinh tế tương đối đa dạng. Tại đây, đang tồn tại nhiều ngành nghề thuộc nhiều lĩnh vực khác nhau như: Công nghiệp khai thác than; du lịch biển đảo; giao thương cửa khẩu. Trong đó, cũng như các địa phương khác chăn nuôi là loại hình kinh tế được người dân áp dụng từ lâu đời.