Các hóa chất có thể xâm nhập vào cơ thể muỗi bằng nhiều cách và ảnh hƣởng đến sự sống sót của chúng ở mức độ khác nhau. Dựa vào khả năng hóa chất bị phân giải trực tiếp hay không khi tác động lên cơ thể muỗi để chia ra các loại cơ chế:
- Giảm thẩm thấu của hóa chất diệt - Thay đổi trong quá trình trao đổi chất - Kháng do biến đổi vị trí đích
24
- Kháng tập tính
1.4.2.1. Kháng giảm thẩm thấu hóa chất diệt
Kháng giảm thẩm thấu hóa chất diệt là cơ chế mà trong đó hóa chất diệt không bị phân hủy trực tiếp, song tính kháng hình thành là do giảm khả năng thấm. Nhiều loại hoá chất diệt côn trùng thâm nhập vào cơ thể côn trùng qua lớp biểu bì. Những thay đổi ở lớp biểu bì của côn trùng làm giảm tốc độ thẩm thấu của hoá chất diệt côn trùng gây nên sự kháng đối với một số hoá chất diệt. Đơn thuần tính thấm giảm chỉ gây ra sự kháng ở mức độ thấp [81].
Cơ chế này hiếm khi đƣợc đề cập tới, nó thƣờng đƣợc coi là thứ yếu thậm chí không đƣợc nhắc tới ở muỗi. Tuy nhiên, nếu phối hợp với các cơ chế kháng khác, nó có thể tạo nên sự kháng cao. Cơ chế này hầu hết đƣợc phát hiện qua các nghiên cứu tính thấm sử dụng hoá chất diệt đánh dấu.
1.4.2.2. Kháng do cơ chế trao đổi chất (metabolic mechanism)
Đây là một trong những cơ chế kháng quan trọng. Một nhóm nhỏ các enzyme hoặc họ các enzyme có liên quan trong tính kháng trao đổi chất. Không có một enzyme nào là enzyme duy nhất liên quan đến tính kháng hoá chất diệt của côn trùng. Sự kháng là kết quả của sự thay đổi về mặt cấu trúc enzyme làm tăng khả năng giải độc của nó hoặc sự tăng số lƣợng enzyme nhằm tăng cƣờng sự đào thải độc tố của hoá chất diệt côn trùng. Các phân tử hóa chất sau khi thâm nhập vào cơ thể, dƣới tác dụng của các enzyme trong cơ thể muỗi sẽ phân hủy chúng theo nhiều con đƣờng khác nhau nhƣ: oxy hóa, thủy phân, hydro hóa, khử clo, ankyl hóa... trở thành chất không độc. Các hệ thống enzyme: esterase, glutathione - S - transferase và cytochrome 450, monooxygenase nhìn chung đƣợc coi là các hệ thống giải độc chủ yếu của các hóa chất diệt côn trùng ở côn trùng [98] tƣơng ứng với các nhóm hóa chất chlo hữu cơ, phốt pho hữu cơ, carbamat và pyrethroid.
25
Esterase
Các esterase là những enzyme xúc tác thủy phân của các ester nhờ có nƣớc (ester + H2O → acid → alchohol). Esterase thƣờng liên quan đến cơ chế chuyển hóa trong nhóm phốt pho hữu cơ, carbamat, nhƣng ít có tác dụng đối với nhóm pyrethroid. Sự kháng có thể tăng lên ở những quần thể côn trùng thông qua quá trình chọn lọc làm tăng số bản sao của gen carboxylesterase (khuếch đại gen). Cơ chế kháng này đã đƣợc nghiên cứu rộng rãi ở các muỗi
Culex [90].
Bên cạnh việc khuếch đại gen, sự kháng còn có thể xảy ra thông qua sự biểu hiện của các carboxylesterase đột biến [107]. Tuy nhiên, cơ chế này cho ra dải kháng chéo hẹp hơn so với cơ chế kháng esterase khuếch đại [66]. Sự chuyển glycine thành axit aspartic trong một vị trí hoạt động của esterase (ký hiệu là αE gen E3) [79] dẫn đến sự kháng đối với diethyl organophosphate (diazinon, parathion) ở Lucilia sericata và Musca domestica. Một đột biến khác trong vị trí hoạt động E3 là nguyên nhân kháng dimethyl organophosphate (malation) ở Musca domestica, Lucillia cuprina và ong ký sinh Anisopteromalus calandrae. Ở những côn trùng này xuất hiện một đột biến tryptophan thành leucine ở M. domestica và L. cuprina và thành glycine ở A. calandrae [43].
Glutathione - S - ransferase
Các enzyme glutathione - S - transferase (GST. EC 2.5.1.1) liên kết với glutathione vào hóa chất diệt côn trùng hoặc các sản phẩm chuyển hóa độc chất đầu tiên của nó (RX + glutathione → R-S-glutathione) [54]. Lớp enzyme này rất quan trọng trong sự kháng đối với các chất diệt có nguồn gốc phốt pho hữu cơ và pyrethroid. Các GST cũng xúc tác quá trình thủy phân Chlorin của DDT thành chất không độc DDE (1,1-dichloro-2,2-bis-(p-chlorophenyl)
26
ethane) (Hình 1.3). Các chỉ số tăng lên của quá trình thủy phân Chlorin của DDT phù hợp với sự kháng DDT có ở nhiều loài côn trùng nhƣ Aedes aegypti, An. gambiae và An. dirus [61,87,88].
Hình 1.3. Cơ chế khử độc của DDT
Cytochrome 450 - monooxygenase độc lập
Các cytochrome 450 - monooxygenase độc lập (EC 1.14.14.1) đầu tiên tìm thấy ở mạng lƣới nội chất và ti thể. Để oxy hóa hóa chất diệt hệ thống P450 tạo ra flavoprotein P450 reductase để xúc tác việc chuyển điện tử từ NADPH (RH + O2 + NADPH +H+ → ROH +H2O + NADP+). Monooxygenases liên quan đến sự chuyển hóa của nhóm pyrethroid, hoạt hóa hoặc khử oxy trong nhóm phốt pho hữu cơ, nhƣng ít có tác dụng đối với nhóm carbamat. Monooxygenase là một phức họ các enzyme đóng vai trò trong chuyển hóa chất sinh học lạ (xenobiotics) và trong chuyển hóa nội sinh
(endogenous metabolism). Các monooxygenases P450 đóng vai trò quan trọng trong việc thích nghi với hóa chất của côn trùng. Sự gia tăng của enzyme này có liên hệ chặt chẽ với sự kháng hóa chất nhóm pyrethroid của
An. stephensi, An. subpictus, An. gambiae và C. quinquefasciatus. Sự kháng đƣợc tạo ra hoặc do mức độ biểu hiện tăng lên hoặc do một đột biến ở gen cấu trúc. Sự kháng là kết quả của một đột biến ở gen quy định enzyme làm thay
27
đổi cấu trúc enzyme do đó tăng khả năng giải độc của nó hoặc tăng số lƣợng enzyme dẫn đến tăng sự đào thải độc tố hoá chất diệt côn trùng ra khỏi cơ thể chúng.
1.4.2.3. Kháng do biến đổi vị trí đích (Target-Site Resistance)
Sự kháng này gây ra bởi sự biến đổi vị trí đích tác động của hoá chất diệt côn trùng. Sự biến đổi đó đã đƣợc quan sát thấy ở các enzyme và cơ quan cảm nhận thần kinh, đó là điểm đích của một số lớp hoá chất diệt côn trùng. Có 3 hình thức kháng hoá chất diệt côn trùng bằng cách thay đổi vị trí đích nhạy cảm (Hình 1.4) [40, 42].
Hình 1.4. Cơ chế kháng do thay đổi vị trí đích ở mức độ phân tử (theo Brogdon WG., 1998) [42].
A. Đột biến ở một axit amin ở vùng màng cầu nối IIS6 của gen kênh vận chuyển Na+ gây kháng DDT ở An. gambiae.
B. Nhân tố điều hòa (phía trên trình tự mã hóa) hay còn gọi là “Barbie Box” cho phép cảm ứng các gen kháng mã hóa esterase và oxidase phân hủy hóa chất diệt côn trùng.
C. Đơn vị siêu sao chép A2-B2 Esterase. Các gen Esterase kháng này nằm ở đầu 3‟ tới đầu 5‟ trong cùng một đơn vị khuyếch đại.
28
Các hóa chất phốt pho hữu cơ (Organophosphates) và Carbamat chỉ có một enzyme vị trí đích là acetylcholinesterase trong khi pyrethroid và DDT có vị trí đích là kênh vận chuyển cổng điện thế Na của màng thần kinh. Các vị trí đích khác nhau của các hóa chất diệt côn trùng gây độc thần kinh là thụ thể cổng phối tử axit γ-aminobutyric (GABA) và thụ thể acetylcholine nicotin (nAchR) (Hình 1.5).
Hình 1.5. Cơ chế tác động gây chết muỗi của 4 nhóm hóa chất (WHO, 2006) [112]
Vị trí đích của các nhóm Phốt pho hữu cơ và Carbamate là enzyme Acetylcholinesterase và vị trí đích của nhóm hóa chất Pyrethroid và DDT là cổng điện thế của kênh vận chuyển ion natri. (AChE: Enzyme Acetylcholinesterase, ACh: Chất dẫn truyền thần kinh Acetylcholine, ChAT: Enzyme vận chuyển Acetylcholine, vg-Na+ chanel: Kênh vận chuyển ion natri, MACE: Enzyme Acetylcholine đã bị thay đổi, Kdr: Kháng hạ gục).
29
Các kênh cổng điện thế
Trong số các kênh cổng điện thế, kênh Na cổng điện thế là vị trí đích cho cả pyrethroid và DDT [74]. Kênh Na ở côn trùng có cấu trúc và chức năng giống nhƣ kênh Na ở động vật có vú và gồm bốn miền khác nhau (DI- DIV), mỗi miền có 6 đoạn chuyển màng (SI-S6). Các kênh Na cổng điện thế giữ vai trò chung và truyền thông tin của các điện áp hoạt động trong các tế bào thần kinh. Khi màng thần kinh ở trạng thái nghỉ, kênh Na cổng điện thế đóng lại. Tuy nhiên, vào lúc hoạt động, màng trở nên linh động làm cho kênh Na mở ra. Sau khoảng một phần triệu giây, hiện tƣợng không hoạt động lại xảy ra do một sự thay đổi thông tin ở kênh Na làm cản trở sự vận chuyển các ion qua màng. Khi điện áp màng trở lại trạng thái nghỉ, kênh đóng lại [102].
Pyrethroid và DDT làm thay đổi động lực cổng của các kênh Na nhạy cảm điện thế bằng việc làm chậm cả trạng thái hoạt động và không hoạt động của các kênh bằng cách kéo dài dòng Na+
kết hợp với một điện áp hoạt động [103]. Nhìn chung các pyrethroid dạng II (pyrethroid có một nhóm α-cyano, ví dụ deltamethrin) trì hoãn trạng thái không hoạt động ở kênh Na cổng điện thế tồn tại dài hơn các hợp chất dạng I (ví dụ cismethrin và permethrin) [82].
Một cơ chế kháng lại pyrethroid và DDT đƣợc gọi là kháng ngã gục (Kdr) lần đầu tiên đƣợc phát hiện và mô tả ở ruồi nhà (Musca domestica) vào những năm 1950. So sánh các trình tự nucleotide từng phần và toàn bộ gen Kdr của các chủng ruồi nhà đã xác định hai đột biến điểm đi đôi với các kiểu hình kháng nhƣ đột biến leucin thành phenylalanine ở aminoacid 1014 (đặt tên là L1014F) và Methionine thành Threonine ở acid amin 918 (đặt tên là M918T; đột biến siêu ngã gục: super- Kdr mutation) ở các chủng kháng pyrethroid cao [114]. Nghiên cứu các đột biến gen Kdr cũng đã đƣợc xác định
30
ở các gen liên quan đến thần kinh. Tổng số hơn 20 đa hình trình tự axit amin trên gen quy định kênh Na đƣợc cho là liên quan với Kdr.
Cho đến nay, chỉ có một số ít loài Anopheles đƣợc phân tích sự hiện diện của các đột biến kháng Kdr. Các đột biến Kdr đã đƣợc xác định ở An. culicifacies, An. sacharoni, An. stephensi, An. subpitus, An. sinensis, An. arrabiensis và An. gambiae [73]. Ở muỗi truyền sốt rét Châu Phi An. gambiae s.s. hai đột biến Kdr L1014S và L1014F đã đƣợc tìm thấy [73,63]. Ở Đông Phi, kháng “Kdr” liên quan đến một đột biến thay thế leucine bằng phenylalanine ở mảnh S6 thuộc domain thứ 2 của alen Kdr (L1014F). Một dạng đột biến khác cũng đƣợc tìm thấy tại Kenya, đó là đột biến thay thế leucine bằng serine ở vị trí tƣơng tự (L1014S). Đối với đột biến Kdr L1014F đã xác định đƣợc có mối liên quan giữa sự hiện diện của đột biến ở mức độ quần thể và tỉ lệ sống sót khi tiếp xúc với permethrin [73]. Tuy nhiên, những nghiên cứu gần đây đã đặt câu hỏi nghi ngờ về vai trò của đột biến Kdr L1014F trong tham gia vào kiểu hình kháng vì những muỗi Anopheles mang đột biến không sống sót khi tiếp xúc với hóa chất diệt côn trùng. Vai trò của đột biến Kdr L1014S ít đƣợc nghiên cứu hơn nhƣng có thể thấy rằng đột biến này liên quan đến kháng DDT ở mức độ cao và kháng nhóm pyethroid ở mức độ thấp [73,63].
Các kênh cổng phối tử
Các kênh ion cổng phối tử tiếp nhận các tín hiệu hóa chất (các chất dẫn truyền thần kinh) biến đổi trực tiếp thành tín hiệu điện thông qua việc mở các kênh ion bộ phận của chúng.
Các thụ thể GABA côn trùng (Hình 1.6) phản ứng với chất dẫn truyền thần kinh axit gama-aminobutyric thông qua việc mở kênh chloride. Kênh ion chloride GABA là một vị trí tác động của các hóa chất diệt côn trùng
31
cyclodiene (ví dụ: dieldrin) và các phenylpyrazole (ví dụ: fipronil) [57]. Thụ thể GABA đƣợc hợp thành từ 5 tiểu phần. Mỗi một tiểu phần gồm một vòng thắt bao nang ngoài màng cellulo và bốn miền xuyên màng (M1-M4). Cơ chế kháng là do sự thay đổi một nucleotide trong một bộ ba mã hoá của gen tổng hợp nên thụ thể, qua đó làm giảm độ nhạy của thụ cảm thể đối với hiệu lực độc của hoá chất diệt côn trùng. Miền xuyên màng M2 nằm ở kênh ion và gồm có một axit amin ở vị trí 302 thƣờng là alanine. Ở các loài muỗi, sự thay đổi alanine thành serine ở codon 302 đi liền với kháng dieldrin ở muỗi Aedes aegypti, An. stephensi và An. arabiensis, trong khi đó đột biến alanine thành glycine ở codon 302 thì lại liên quan đến kháng dieldrin ở muỗi An. gambiae s.s [53]. Những đột biến ở codon 302 là bán trội nên đã gây nên kháng ở mức độ cao ở các cá thể đồng hợp tử và kháng ở mức độ trung bình ở những cá thể dị hợp tử . Những đột biến ở codon 302 có thể tồn tại lâu dài ở các quần thể côn trùng sau khi áp lực chọn lọc đã giảm đi.
Hình 1.6. Cấu trúc của GABA
Các thụ thể acetycholine nicotine (nAChRs) mở kênh ion của chúng dƣới tác động của chất dẫn truyền thần kinh Acetylcholin (ACh). Nicotine cũng có thể mở thụ thể acetylcholine nicotine. Các nAChRs là các protein vận chuyển màng có năm phần (pentameric). Gần đây, năm tiểu phần nAChR (NIα1- NIα4 và NIβ1) đã đƣợc nhân dòng từ bọ nhảy nâu Nilaparnata lugens
và một so sánh các tiểu phần nAChR từ các quần thể nhậy và kháng đã phát hiện một đột biến điểm đơn ở một vị trí cố định (Y1513) trong hai tiểu phần nAChR Niα1 và Niα3 [70].
32
Hiện tượng trơ hoặc thay đổi enzyme acetylcholinesterase (MACE: Modified acetylcholinesterase)
Các acetylcholinesterase (AChE, EC.3.1.1.7) dẫn truyền các xung thần kinh bằng xúc tác thủy phân chất dẫn truyền thần kinh acetylcholine (acetylcholine thành axit acetic + choline). Các chất phốt pho hữu cơ và carbamat làm ngừng hoạt động enzyme bằng cách photphoryl hóa hoặc carbamyl hóa serine ở trung tâm hoạt động của enzyme. Điều đó làm cho côn trùng bị chết vì quá trình dẫn truyền xung động thần kinh tại các xynap không thể thực hiện đƣợc. Tuy nhiên việc sử dụng quá nhiều các chất phốt pho hữu cơ và carbamat đã làm xuất hiện một số loài côn trùng kháng mang gen AChE bị đột biến [76].
Các đột biến đơn lẻ gây mức độ kháng thấp và ảnh hƣởng không rõ nét lên mức độ thủy phân chất dẫn truyền thần kinh trong khi đó tập hợp nhiều đột biến lại gây ra sự kháng mạnh. Gen ace khác (ace -1) có thể đáp ứng giảm tính nhạy cảm AChE ở các chủng của các loài muỗi An. gambiae, An. albianus, Culex pipiens và Cx. quinquefasiatus. Sự giảm tính nhạy cảm của AChE ở những loài muỗi này là do sự biến đổi glycine thành serine (G1193C) ở gen ace -1. Có sự phù hợp cao giữa các đột biến ace -1 với sự giảm nhạy cảm của AChE [68]. Ở muỗi Cx. tritaeniorhynchus, sự kháng phốt pho hữu cơ là do một thay đổi axit amin ở codon 331 của ace -1 (F331W) [77].
1.4.2.4. Sự kháng do tập tính
Những thay đổi tập tính thông qua việc giảm tiếp xúc với hoá chất diệt có thể làm tăng khả năng sống sót của côn trùng. Những thay đổi bao gồm sự giảm xu hƣớng bay vào vùng sử dụng hoá chất hay tránh xa khỏi bề mặt có hoá chất khi việc tiếp xúc xảy ra. Tuy nhiên, sự kháng này cũng hiếm khi đƣợc đề cập đến và giống nhƣ hậu quả thay đổi gây ra trực tiếp bởi sự có mặt
33
của hoá chất diệt côn trùng hoặc do những con muỗi sống trong nhà của quần thể muỗi bị tiêu diệt.