- Các địa điểm thu thập mẫu: Quảng Ninh, Bắc Kạn, Ninh Bình, Nghệ An, Quảng Bình, Quảng Trị, Phú Yên, Khánh Hòa, Bà Rịa Vũng Tàu. Đây là những địa điểm đã xác định có sự phân bố của các thành viên trong nhóm loài Anopheles leucosphyrus theo những nghiên cứu của các tác giả trƣớc.
- Địa điểm nghiên cứu phòng thí nghiệm:
+ Khoa Sinh học Phân tử, Viện Sốt rét Ký sinh trùng và Côn trùng Trung ƣơng, Việt Nam.
+ Khoa Côn trùng, Đại học Nagasaki, Nhật bản. 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Thiết kế nghiên cứu
- Nghiên cứu điều tra mô tả cắt ngang thu thập mẫu vật tại thực địa (tiến hành vào mùa phát triển của vector)
- Hồi cứu số liệu: kiểm tra mẫu vật cũ, các mẫu vật hiện có tại Viện Sốt rét-Ký sinh trùng-Côn trùng Trung ƣơng, các mẫu vật hiếm gặp, khó thu thập.
- Phân tích mẫu tại phòng thí nghiệm
2.3.2. Mẫu nghiên cứu
Mẫu nghiên cứu là những mẫu đƣợc chọn có chủ đích:
- Phân tích đặc điểm sinh học, đa hình di truyền của các quần thể vector tối thiểu mỗi quần thể, mỗi loài cần phân tích 30 mẫu để đảm bảo mẫu tối thiểu cho thống kê sinh học.
- Phân tích thành phần KST trong muỗi để đánh giá vai trò truyền bệnh: tất cả muỗi bắt đƣợc bằng phƣơng pháp mồi ngƣời, soi trong nhà ngày, bẫy đèn đều đƣợc thử ELISA và kiểm tra lại bằng PCR.
37
- Mẫu muỗi dùng cho thử nghiệm sinh học xác định nhạy kháng với hóa chất diệt côn trùng là muỗi cái Anopheles trƣởng thành (no máu, hoặc muỗi đói thì cho hút nƣớc đƣờng glucose 10%) tại điểm nghiên cứu để thử nghiệm hoặc sử dụng muỗi cái Anopheles 1 – 2 ngày tuổi nuôi ở trong phòng thí nghiệm để thử. Lựa chọn muỗi đạt tiêu chuẩn để thử (khỏe, còn đầy đủ chân cánh...)
2.3.3. Phƣơng pháp thu thập và xử lý mẫu vật tại thực địa
Mẫu đƣợc thu thập bằng các phƣơng pháp chuẩn của tổ chức Y tế thế giới và Viện sốt rét - KST – CT TƢ: mồi ngƣời trong nhà, mồi ngƣời ngoài nhà, soi muỗi đậu ngoài nhà ban đêm, soi muỗi đậu trong nhà ban ngày, soi chuồng gia súc ban đêm và bắt bọ gậy.
- Mồi ngƣời trong nhà ban đêm: Từ 18 giờ đến 6 giờ sáng hôm sau, tại mỗi nhóm chọn 2 nhà để mồi bắt muỗi trong nhà, một ngƣời ngồi bắt muỗi trong 1 nhà, mỗi đêm bắt muỗi chia 2 ca: ca 1 từ 18 giờ đến 24 giờ, ca 2 từ 24 giờ đến 6 giờ (mỗi ca một ngƣời), bắt muỗi trong 3 đêm liên tục.
- Mồi ngƣời ngoài nhà ban đêm: Từ 18 giờ đến 6 giờ hôm sau, mồi ngƣời bắt muỗi ngoài nhà cách nhà (lựa chọn bắt muỗi trong nhà) khoảng 10 mét. Mỗi đêm bắt muỗi chia làm 2 ca: ca 1 từ 18 giờ đến 24 giờ, ca 2 từ 24 giờ đến 6 giờ (mỗi ca một ngƣời), bắt muỗi trong 3 đêm liên tục.
- Bắt muỗi bẫy đèn CDC trong nhà: Từ 18 giờ đến 6 giờ. Trong mỗi nhóm chọn 2 nhà (không trùng với nhà đã chọn làm điểm mồi ngƣời trong nhà và ngoài nhà) để bắt muỗi bằng bẫy đèn trong nhà. Trong mỗi nhà treo một bẫy đèn, bắt muỗi trong nhà bằng bẫy đèn 3 đêm liên tục.
38
- Soi trong nhà ban ngày từ 7 giờ đến 11 giờ: mỗi điểm 10 nhà, mỗi nhà 2 ngƣời x 30 phút
- Soi chuồng gia súc ban đêm từ 19 giờ đến 23 giờ: một điểm soi 5 chuồng mỗi chuồng 2 ngƣời x 30 phút
- Bắt bọ gậy ở các kiểu ổ khác nhau nuôi lên đến trƣởng thành để có mẫu phân tích.
Mỗi xã tiến hành thu thập mẫu trong 10 ngày trong một đợt điều tra Mẫu muỗi thu đƣợc từ các phƣơng pháp trên đƣợc ghi rõ theo từng nhà, từng phƣơng pháp và từng giờ cho mỗi đêm.
Mẫu vật đƣợc định loại hình thái bƣớc đầu tại thực địa. Những muỗi no máu đƣợc giữ cho đẻ trứng và nuôi theo dòng gia đình. Muỗi sống đƣợc bảo quản trong dung dịch nitơ lỏng đem về phòng thí nghiệm để phân tích tiếp. Các mẫu vật khô, đặc biệt là các mẫu vật thu thập bằng các phƣơng pháp mồi ngƣời, bẫy đèn trong nhà, soi trong nhà ban ngày đều đƣợc bảo quản trong ống nghiệm nhỏ có silicagen hút ẩm để mang về phòng thí nghiệm làm ELISA xác định thoa trùng trong muỗi và xác định tính ƣa vật chủ.
Bọ gậy đƣợc thu thập từ các loại ổ nƣớc đƣợc giữ sống về nuôi trong phòng thí nghiệm hoặc ngâm trong cồn Ethanol 90% để phân tích hình thái.
2.3.4. Nghiên cứu trong phòng thí nghiệm
2.3.4.1. Nuôi muỗi
Việc nuôi muỗi trong phòng thí nghiệm nhằm mục đích có các tiêu bản đồng bộ từ trứng đến trƣởng thành để phân tích các dấu hiệu hình thái và phân tích các dấu hiệu di truyền theo dòng gia đình.
Muỗi cái no máu từ thực địa đƣợc chuyển về phòng thí nghiệm cho đẻ trứng và nuôi riêng theo từng lô. Mỗi lô gia đình đều có ký hiệu riêng để tránh
39
nhầm lẫn. Tuỳ mục đích khác nhau mà các mẫu vật đƣợc xử lý và bảo quản theo các phƣơng pháp riêng. Tất cả các lô mẫu vật nuôi theo gia đình đều đƣợc làm tiêu bản đồng bộ các giai đoạn trứng, bọ gậy, quăng và muỗi trƣởng thành.
Ngoài ra các bọ gậy đƣợc bắt từ các ổ tự nhiên cũng đƣợc chuyển về để nuôi cho nở thành muỗi, để phân loại (xác bọ gậy, quăng cũng đƣợc giữ lại để phân tích các dấu hiệu hình thái).
2.3.4.2. Phân loại muỗi dựa trên các dấu hiệu hình thái
Dấu hiệu hình thái từ pha trứng đến pha trƣởng thành đều đƣợc phân tích. Các dấu hiệu hình thái đƣợc định loại theo khóa phân loại của Viện Sốt rét – KST – CTTƢ (2008, 2010).
2.3.4.3. Điện di enzyme và phân tích kết quả điện di
Điện di trên gel cellulose acetate (Itan II, Helena Laboratories, U.K) theo phƣơng pháp của Smith và cs, 1996 [97].
Các hệ enzyme đƣợc nghiên cứu là:
- Glucose phosphate isomerase (GPI, E.C: 5.3.1.9) - Phosphate glucomutase (PGM, E.C: 2.7.5.1) - Isocitrate dehydrogenase (IDH, E.C: 1.1.1.42)
- 6- Phosphogluconate dehydrogenase (6- PGD, E.C: 1.1.1.44) - Glucose phosphate dehydrogenase (- GPD, E.C: 1.1.1.49) - Glutamate oxaloacetate transminase (GOT, E.C: 2.6.1.1)
Đây là một số hệ enzyme thƣờng đƣợc dùng trong xác định loài muỗi. - Tiến hành điện di: sử dụng bộ điện di HELENA tiến hành với điều kiện cƣờng độ dòng điện là 80mA. Bộ điện di đƣợc làm lạnh nhờ các tấm bọt biển lạnh. Thời gian điện di tuỳ thuộc vào từng loại enzyme.
40
- Nhuộm, phân biệt các enzyme: Sau khi điện di trên các gel khác nhau thu đƣợc các tiểu phần trên bản điện di không mầu. Muốn nhận biết phải dùng phƣơng pháp nhuộm đặc hiệu đối với từng loại enzyme. Thông thƣờng, muốn nhận biết một enzyme cũng nhƣ một isozyme nào đó ta cần có cơ chất tƣơng ứng, các coenzyme nhƣ: NAD, NADP, NADH…, các chất tạo mầu NBT, MTT, Fast Blue, Fast Garnet…và chất truyền điện tử PMS. Các dung dịch đệm thích hợp cho nhuộm mầu tuỳ theo các enzyme tƣơng ứng.
- Cách đọc kết quả điện di đƣợc mô tả chi tiết trong phần phụ lục 3 - Xử lý số liệu:
Sử dụng phần mềm TFPGA version 1.3 (Mark P. Miller, 1997) để xử lý các số liệu thu đƣợc. Xác định tần số alen: p = (2a + b) / (2N) q = (2c + b) / (2N) Trong đó: a: số cá thể đồng hợp theo A b: số cá thể dị hợp AA1 c: số cá thể đồng hợp theo A1 N: số cá thể nghiên cứu Kiểm định 2 2 = (O - E)2/E
Bậc tự do = số kiểu gen thu đƣợc – số alen Trong đó: O: tần số thực nghiệm
E: tần số lý thuyết
Hệ số tƣơng đồng di truyền (I): tính theo Nei (1972, 1978) xi.yi I = xi 2 . yi 2 .
41
Trong đó: xi là tần số alen thứ i của loài x yi là tần số alen thứ i của loài y
Khoảng cách di truyền (D) D = - ln I
2.3.4.4. Kỹ thuật ELISA xác định ký sinh trùng trong muỗi.
Kỹ thuật ELISA xác định ký sinh trùng trong muỗi đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp của Wirtz và cs, (1987). Bộ Kit ELISA của Plasmodium falciparum (P.f Mabs), Plasmodium vivax 210 (P.v 210 Mabs), Plasmodium vivax 247 (P.v 247 Mabs) đƣợc sử dụng trong thí nghiệm là do CDC Entomology Branch, Atlanta, Hoa Kỳ cung cấp. Các bƣớc tiến hành đƣợc mô tả chi tiết trong phần phụ lục 3.
2.3.4.5. Kỹ thuật PCR bán lồng đa mồi (semi nested multiplex PCR) xác định KST trong muỗi
Bảng 2.1. Trình tự mồi để xác định KST trong muỗi
Ký hiệu mồi Đặc hiệu loài Kích thƣớc sản phẩm PCR (bp) Trình tự
UNR Universal 5´-GAC GGT ATC TGA TCG TCT TC-3'
PLF Plasmodium 783-821 5´-AGT GTG TAT CAA TCG AGT TTC-3' FAR P.falciparum 395 5´-AGT TCC CCT AGA ATA GTT ACA -3' MAR P.malariae 269 5´-GCC CTC CAA TTG CCT TCT G-3'
OVR P.ovale 436 5´-GCA TAA GGA ATG CAA AGA ACA G-3' VIR P.vivax 499 5´-AGG ACT TCC AAG CCG AAG C-3'
42
Kiểm tra các mẫu ELISA dƣơng tính bằng kỹ thuật PCR bán lồng đa mồi theo Rubio J.M (2002) [91] để xác định 4 loài ký sinh trùng sốt rét.
* Tách chiết và tinh sạch ADN
Tách chiết, tinh sạch ADN bằng QIAamp DNA Micro Kit của hãng Qiagen theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất.
* Kỹ thuật PCR bán lồng đa mồi (semi nested multiplex PCR)
Phản ứng PCR để nhân bản gen đặc hiệu của giống Plasmodium gọi là Nested1. Các mồi đƣợc sử dụng cho phản ứng lần 1 và lần 2 có trình tự nhƣ ở bảng 2.1. Thành phần phản ứng đƣợc trình bày trong bảng 2.2.
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR lần 1 nhân bản đoạn gen chung của giống Plasmodium
Hóa chất Thể tích cho 1 đơn vị phản ứng( µl ) Nồng độ cuối cùng Qiagen 10X buffer 5 dNTP 0,5 200µM PLF 1 0.5pmol UNR 1 0.5pmol MilliQ 37,3
Taq polymerase 0,2 1 đơn vị
ADN mẫu 5
43
Chu trình nhiệt của phản ứng lần 1 là: 950
C- 5 phút. Sau đó là 40 chu kỳ 940C- 60 giây, 600C- 1 phút, 720C- 1 phút 30 giây, giữ ở 720C- 10 phút và cuối cùng giữ ở nhiệt độ 150
C.
Sản phẩm PCR lần một đƣợc pha loãng 500 lần và là khuôn cho phản ứng PCR đa mồi lần 2 để nhân bản đặc hiệu đoạn gen của 4 loài ký sinh trùng sốt rét. Thành phần của phản ứng PCR lần 2 đƣợc trình bày ở bảng 2.3.
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR đa mồi phát hiện 4 loài KST SR
Hóa chất Thể tích cho 1 đơn vị
phản ứng( µl ) Nồng độ cuối cùng Qiagen 10X buffer 2.5 dNTP 0,25 200 pmol/µl PLF 1 1pmol/µl FAR 1 0.6pmol/µl MAR 1 0.125pmol/µl VIR 1 0.1pmol/µl OVR 1 0.25pmol/µl MilliQ 15.05
Taq polymerase 0,2 1 đơn vị
ADN khuôn 2
Tổng thể tích 25
Kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di trên gel agarose 2% với điện thế 110V, điện áp 75mA với thời gian là 30 phút.
44
2.3.4.6. Tách chiết ADN của muỗi
Các mẫu có thể bảo quản khô ở nhiệt độ phòng hoặc ở -200C để tách chiết ADN. Tùy thuộc vào điều kiện của từng mẫu, ADN có thể thu đƣợc từ chân hoặc các phần khác của cơ thể (nhƣ cánh, đầu nhƣng không lấy phần bụng của con cái trƣởng thành). ADN đƣợc tách chiết theo REDExtract-N- AmpTM Tissue PCR Kit (Sigma) theo hƣớng dẫn của nhà sản suất có sửa đổi để tách chiết từ mô động vật. Dung dịch ADN đƣợc bảo quản ở 40C cho phản ứng PCR.
2.3.4.7. Kỹ thuật PCR nhân bản đoạn COI và ND6
Các dấu chuẩn phân tử và các mồi đƣợc lựa chọn theo Sallum và cộng sự (2007)[93].
Mồi để nhân bản một phần đoạn gen COI và ND6 có ký hiệu và trình tự đƣợc trình bày trong bảng 2.4.
Bảng 2.4. Trình tự mồi nhân bản đoạn COI và ND6
Ký hiệu mồi
Trình tự mồi Kích thƣớc
sản phẩm (bp)
UEA9.2 5'-CTA ACA TTT TTT CCT CAA CAT TTT TTA GG -3'
COI- 221bp (Không kể mồi)
UEA10.2 5'- TTA TTA TTA GTT AAT AAT AAY GGT ART TCT G-3'
ND6.F2 5'- TTG GWC GTA AWG GWC CAT AAA A -3' ND6-349bp (Không kể mồi)
ND6.R3 5'- CAR GAA TYT ATG TAA AAA CAT TTT G -3'
Điều kiện phản ứng PCR nhân bản đoạn gen COI: tổng thể tích phản ứng là 20μl gồm 2μl đệm 10x EXTaq (Takara, Nhật bản), 0,2 μM dNTPs,
45
0,5μM mồi UEA9.2, 1μM mồi UEA10.2, 0,1 μl EXTaq (Takara) và 1-2 μl ADN tách chiết.
Điều kiện phản ứng PCR nhân bản đoạn gen ND6 tƣơng tự nhƣ COI chỉ khác là sử dụng 1,0 μM mồi ND6F2 và ND6R3.
Chu trình nhiệt cho COI nhƣ sau: 5 chu kì: 30 giây ở 94°C, 30 giây ở 37°C và 30 giây ở 72°C, tiếp theo là 40 chu kì: 30 giây ở 94°C, 30 giây ở 47°C và 30 giây ở 72°C, cuối cùng là 2 phút ở 72°C.
Chu trình nhiệt cho ND6 là: 5 chu kì: 30 giây ở 94°C, 30 giây ở 37°C và 30 giây ở 72°C, tiếp theo là 45 chu kì: 30 giây ở 94°C, 30 giây ở 49°C và 30 giây ở 72°C, cuối cùng là 2 phút ở 72°C.
Sản phẩm PCR đƣợc phát hiện trên gel agarose 2% nhuộm ethidium bromide. Kích thƣớc các băng thu đƣợc đƣợc so sánh với thang ADN chuẩn.
2.3.4.8. Giải trình tự đoạn COI và ND6
Sản phẩm PCR thu đƣợc sau khi nhân bản đoạn COI và ND6 đƣợc tinh sạch bằng ExoSAP-IT (GE Healthcare Japan). Pha loãng ExoSAP-IT 10 lần với nƣớc khử ion, thêm 2μl dung dịch vừa pha loãng vào 5μl sản phẩm PCR, ủ ở 370C trong 30 phút và sau đó bất hoạt enzyme bằng cách ủ ở 800
C trong 15 phút. Các sản phẩm của phản ứng đƣợc tinh sạch bằng kết tủa cồn và hòa tan trong Formamide Hi-DiTM theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất và các trình tự này đƣợc xác định bằng máy giải trình tự ABI PRISM 3730.
2.3.4.9. Lập cây chủng loại phát sinh
Các phƣơng pháp kết nối liền kề (neighbor joining - NJ) và tiết kiệm tối đa (Maximum parasimony-MP) đƣợc thực hiện bằng phần mềm MEGA4. Tất cả các vị trí codon đƣợc tính đến và các vùng không rõ ràng đƣợc xem là dữ liệu thiếu. Các cây đƣợc tạo ra từ dữ liệu trên là cây có nguồn gốc sử dụng nhóm
46
đối chứng. Trong cây chủng loại phát sinh đƣợc xây dựng bằng phƣơng pháp NJ, khoảng cách tiến hóa đƣợc tính toán bằng phƣơng pháp Juked- Cantor. Để đánh giá độ tin cậy của cây chủng loại phát sinh xây dựng theo phƣơng pháp NJ, kiểm nghiệm Bootstrap và kiểm nghiệm nội nhánh (trong nhánh) đƣợc thực hiện với 2000 lần lặp lại. Ở cây chủng loại xây dựng theo phƣơng pháp MP, chiều dài nhánh đƣợc tính toán bằng phƣơng pháp đƣờng trung bình và đƣợc biểu hiện thông qua các đơn vị số lƣợng thay đổi trên toàn bộ trình tự.
2.3.4.10. Tạo chủng muỗi kháng với permethrin từ muỗi An. dirus chủng nuôi trong phòng thí nghiệm
Chủng muỗi nhạy An. dirus nuôi trong phòng thí nghiệm đƣợc coi nhƣ thế hệ F0. Thế hệ bọ gậy F1 và các thế hệ tiếp sau đó đƣợc coi là đối tƣợng để gây áp lực lựa chọn chủng kháng.
Hóa chất đƣợc sử dụng là permethrin 10,9 % hoạt chất (hãng Shell cung cấp).
Áp lực lựa chọn: để tạo chủng bọ gậy kháng, permethrin trƣớc hết đƣợc pha trong dung dịch cồn nguyên chất sau đó đƣợc hòa vào cốc nuôi bọ gậy có thể tích nƣớc là 250 ml. Mỗi một thế hệ thử nghiệm 5 nồng độ khác nhau. Những lô tạo ra tỷ lệ chết 50-70% thì đƣợc lựa chọn. Bọ gậy sống sót đƣợc nuôi sinh sản và tạo ra thế hệ sau và tiếp tục tạo áp lực lựa chọn với nồng độ cao hơn ở các thế hệ sau.
Bọ gậy thế hệ F1 và các thế hệ sau đƣợc tiến hành thử nghiệm sinh học theo tiêu chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới WHO/VBC/81.807 [111].
Chuẩn bị dung dịch hóa chất chuẩn trong cồn với nồng độ 1000mg/L. Mỗi lần thử nghiệm 5 nồng độ khác nhau trùng với nồng độ gây áp lực tạo chủng kháng. Mỗi nồng độ đƣợc lặp lại 4 lần (trong 4 cốc) và có một cốc đối
47
chứng không có hóa chất (Bảng phụ lục 4). Nồng độ nào tạo ra đƣợc tỷ lệ chết từ 50-70% thì tiếp tục đƣợc lặp lại ở thế hệ tiếp theo.
Thử nghiệm đƣợc tiến hành trong các cốc giấy có thể tích 300 ml. Pha hóa chất theo các nồng độ đã định vào 250 ml nƣớc nuôi bọ gậy sau 20 phút