RFLP
Bọ gậy tạo dòng kháng đƣợc nuôi thành muỗi trƣởng thành, tất cả các phân tích gen đều tiến hành trên muỗi trƣởng thành.
Phân tích 205 mẫu muỗi An. dirus bao gồm 150 muỗi của dòng kháng, 23 mẫu muỗi còn sống, 15 mẫu đối chứng và 17 mẫu muỗi chết sau các thử nghiệm sinh học bằng kỹ thuật PCR-RFLP.
Đoạn gen kháng ngã gục (Kdr) của An. dirus đƣợc khuếch đại bằng cặp mồi Agd1 và Agd2 có kích thƣớc 301 bp (Hình 3.28).
Hình 3.27. Sản phẩm PCR sử dụng đôi mồi Agd1 và Agd2. Làn 1: Thang chuẩn 100bp Làn 2 – 7: Sản phẩm PCR
Giải trình tự đoạn gen Kdr trên máy ABI3 730, so sánh trình tự với vùng DIIS6 nhận thấy Leucin ở vị trí 1014 đƣợc mã hóa bằng bộ ba mã hóa CTA. Sử dụng hai enzyme giới hạn Fsp1 và XbA có trình tự giới hạn là CTAG và TCTGA đều cắt tại vị trí codon 174 cho ra hai đoạn băng có kích thƣớc tƣơng ứng là 174 và 121 bp.
87
Hình 3.28. Sản phẩm đƣợc hình thành do xử lý bằng enzyme giới hạn Fsp1 Làn 4: thang chuẩn 50bp;
Làn 1- 3, 5,6: sản phẩm sau khi sử lý với enzyme Fsp1 có kích thƣớc 174 và 121 bp Kết quả cho thấy có 190 mẫu muỗi bị cắt hoàn toàn, chứng tỏ những mẫu này là dạng dại không có đột biến Kdr, 15 mẫu muỗi không bị cắt tại vị trí này (bao gồm cả các mẫu tạo chủng kháng, mẫu sống ở lô đối chứng, mẫu chết và muỗi sống trong thử nghiệm sinh học). Mƣời lăm mẫu muỗi này đều đƣợc giải trình tự, phát hiện thấy có sự đột biến ở vị trí codon 174 mã hóa axit amin leucin.
#An.dirus_S1 ATA GAT TCC CCG ACC ATG ACC TAC CAA GAT GGA ATT TTA CGG ATT TCA TGC ACT CTT TCA #An.dirus_R-lambda ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... #An.dirus_R-alpha ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... #An.dirus_R2 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... #An.dirus_R1 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#An.dirus_S1 TGA TTG TAT TTC GGG TGC TGT GTG GAG AAT GGA TTG AAT CCA TGT GGG ACT GCA TGC TCG #An.dirus_R-lambda ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... #An.dirus_R-alpha ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... #An.dirus_R2 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... #An.dirus_R1 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#An.dirus_S1 TTG GCG ATG TGT CTT GCA TTC CCT TCT TCT TGG CAA CCG TAG TAA TAG GAA ATC TAG TGG #An.dirus_R-lambda ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .T. ... #An.dirus_R-alpha ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... A.. ... #An.dirus_R2 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... #An.dirus_R1 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... A.. ...
88
#An.dirus_S1 TAC GTA TGC GGT TAG CTT CCA CCG TCG GTA GAT CAA CCA TTA ATG GTG GGC TTT TCT GTT #An.dirus_R-lambda ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... #An.dirus_R-alpha ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... #An.dirus_R2 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... #An.dirus_R1 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#An.dirus_S1 GCA GGT GCT TAA TCT TTT CTT AGC CTT GCT TTT AAA CTT CGG TTC ATC ATC CTT GTC T #An.dirus_R-lambda ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . #An.dirus_R-alpha ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . #An.dirus_R2 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . #An.dirus_R1 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .
Xét trình tự ADN của đoạn gen ở các mẫu An. dirus đƣợc khuếch đại bởi mồi Adg và Adg 2 cho thấy một số muỗi có đột biến ở vị trí codon 174 đến 176 nhƣng không tạo thành bộ ba mã hóa cho axit amin pheninalanin, serin, histidin hay cystein là những đột biến có biểu hiện kháng ngã gục.