các chỉ thị phân tử
Tiến hành phản ứng PCR nhân đoạn gen COI và ND6 với các mẫu thu thập đƣợc tại các tỉnh Nghệ An, Bình Thuận, Bình Phƣớc, Bắc Kạn, Phú Yên. Sản phẩm khuếch đại đoạn gen COI và ND6 có kích thƣớc tƣơng ứng là 221 bp và 349 bp (Hình 3.22 và Hình 3.23).
77
Hình 3.22. Hình ảnh sản phẩm PCR khuếch đại gen COI của các quần thể nghiên cứu
Làn 1, 2, 3, 5, 6, 7: đoạn COI có kích thƣớc 221 bp Làn 4 : thang chuẩn 100bp
Hình 3.23. Hình ảnh sản phẩm PCR khuếch đại gen ND6 của các quần thể nghiên cứu
Làn 1, 3, 4, 5, 6, 7: đoạn ND6 có kích thƣớc 349 bp Làn 2 : thang chuẩn 100bp
221 bp
78
Sản phẩm PCR thu đƣợc đem giải trình tự và tiến hành lập cây chủng loại phát sinh, xem xét mối quan hệ giữa các mẫu muỗi trong nhóm loài Anopheles leucosphyrus ở Việt Nam. Cây chủng loại phát sinh đƣợc xây dựng dựa trên dữ liệu giải trình tự đoạn COI và ND6 của các mẫu nghiên cứu và các trình tự từ ngân hàng gen (Genbank) của các thành viên khác trong nhóm loài Anopheles leucosphyrus (trong nhóm là 37 mẫu) và 4 loài thuộc giống Anopheles khác (ngoài nhóm) để tiến hành so sánh.
79
Hình 3.24. Cây chủng loại phát sinh theo phƣơng pháp NJ của nhóm loài Anopheles leucosphyrus theo trình tự gen COI và ND6 Khoảng cách tiến hóa đƣợc tính toán bằng phƣơng pháp Juke-Cantor dựa vào trình tự COI (221bp) và ND6 (349bp) của gen ty thể. Thử nghiệm Bootstrap và nội nhánh đƣợc thực hiện với 2000 lần lặp lại mỗi giá trị lớn hơn hoặc bằng 50% đƣợc chỉ ra ở phía trên (giá trị Bootstrap) và dƣới (độ đồng nhất trong kiểm nghiệm nội nhánh) của các nhánh. (Những mẫu mầu đỏ là những mẫu giải trình tự, những mẫu còn lại lấy thông tin từ ngân hàng gen).
80
Ở cây chủng loại phát sinh phân tử đƣợc xây dựng bằng phƣơng pháp NJ (Hình 3.24), các kiểu đơn 18-22 của mẫu Bắc Kạn tạo thành một nhánh riêng biệt với độ đồng nhất trong kiểm nghiệm bootstrap (91%) và nội nhánh (97%) cao; nhánh này đƣợc tách ra từ các kiểu đơn của cả An. takasagoensis
và An. dirus. Nhánh này sau đó đƣợc nhóm lại với các kiểu đơn 26-28 An. balabacensis, nhƣng độ đồng nhất trong kiểm nghiệm bootstrap và nội nhánh thấp hơn với giá trị nhỏ hơn 50%. Những mẫu đơn khác trong nghiên cứu này (kiểu đơn 1-17), bao gồm cả những mẫu muỗi thu thập ở Nghệ An nhóm lại với nhau cùng với An. dirus của Thái Lan, An. baimaii của Thái Lan, Myanmar và Bangladesh. Nhánh (An. dirus + An. baimaii) sau đó đƣợc nhóm lại với An. elegans của Ấn Độ với độ đồng nhất trung bình trong kiểm nghiệm bootstrap và độ đồng nhất cao trong kiểm nghiệm nội nhánh (đƣợc chỉ ra bằng mũi tên trong hình 3.24). Tiếp đến, An. takasagoensis đƣợc nối với nhánh (An. dirus + An.baimaii + An. elegans), và An. crasens nối với nhánh (An. dirus + An. baimaii + An. elegans+ An. takasagoensis), sau đó nhánh này lại gộp với An. scaloni với độ đồng nhất trung bình trong cả kiểm nghiệm bootstrap lẫn kiểm nghiệm nội nhánh. Các thành viên trong phức hợp Dirus, An.balabacensis và các mẫu Bắc Kạn tạo thành một nhánh với độ đồng nhất cao trong kiểm nghiệm bootsrap và nội nhánh.
Nhìn chung trong cây theo phƣơng pháp NJ, những mẫu muỗi trong nghiên cứu này thuộc về phân nhóm Leucosphyrus. Các mẫu muỗi thu thập ở Nghệ An, Bình Thuận, Bình Phƣớc và Phú Yên thuộc phức hợp loài Dirus (Dirus complex), còn muỗi thu thập ở Bắc Kạn lại thuộc phức hợp loài Leucosphyrus (Leucosphyrus complex) (Hình 3.24).
81
.
Hình 3.25. Cây chủng loại phát sinh theo phƣơng pháp MP của nhóm loài Anopheles leucosphyrus theo trình tự gen COI và ND6 Chiều dài của các nhánh đƣợc tính toán bằng cách sử dụng đƣờng trung bình An. gambiae và An. quandrimaculatus là các taxa đối chứng. (Màu đỏ chỉ các mẫu đƣợc giải trình tự trong nghiên cứu, màu đen là những mẫu trong ngân hàng gen)
82
Ở cây chủng loại theo phƣơng pháp MP (tiết kiệm tối đa) (Hình 3.25), các kiểu đơn 18-22 của các mẫu Bắc Kạn cũng tạo thành một nhánh với độ đồng nhất 100%, nhánh này đƣợc tách ra từ các kiểu đơn của cả An. takasagoensis và An. dirus. Các kiểu đơn Bắc Kạn sau đó nhóm lại với các kiểu đơn 26-28 của An. balabacensis với độ đồng nhất 66% .
Những kiểu đơn khác thu đƣợc trong nghiên cứu này (các kiểu đơn 1- 17), bao gồm cả các mẫu muỗi thu ở Nghệ An nhóm lại với nhau cùng với
An. dirus Thái Lan và An.baimaii Thái Lan, Myanmar và Bangladesh với độ đồng nhất 81%. Tiếp đó, cấu trúc {[(An. dirus, An. baimaii) An. elegans] An. takasagoensis) An. cracens} đƣợc tạo ra với độ đồng nhất 100% (đƣợc chỉ ra bởi mũi tên ở hình 3.25). Nhánh này đƣợc nhóm với An. scanloni và nhánh (An. balabacensis + các mẫu Bắc Kạn ) với độ đồng nhất 66% và tiếp tục kết hợp với nhánh An. neumophilous với 100% độ đồng nhất. Nhánh này sau đó lại kết hợp với nhánh [(An. sulawesi + An. mirans: phân nhóm Hackeri) + An. mirans: phân nhóm Riparis] với độ đồng nhất 100%, trong khi đó An. leucosphyrus và An. latens tạo thành với dòng cơ bản chính và dòng cơ bản thứ cấp tƣơng ứng trong nhóm loài Anopheles leucosphyrus. Tóm lại, các mẫu muỗi thu đƣợc ở Nghệ An, Bình Thuận, Bình Phƣớc, Phú Yên tạo thành một nhánh thuộc phức hợp loài Dirus (Dirus complex), còn muỗi Bắc Kạn tách thành một nhánh riêng. Cả hai nhánh này đều thuộc nhóm loài Anopheles leucosphyrus.