2.3.4.1. Nuôi muỗi
Việc nuôi muỗi trong phòng thí nghiệm nhằm mục đích có các tiêu bản đồng bộ từ trứng đến trƣởng thành để phân tích các dấu hiệu hình thái và phân tích các dấu hiệu di truyền theo dòng gia đình.
Muỗi cái no máu từ thực địa đƣợc chuyển về phòng thí nghiệm cho đẻ trứng và nuôi riêng theo từng lô. Mỗi lô gia đình đều có ký hiệu riêng để tránh
39
nhầm lẫn. Tuỳ mục đích khác nhau mà các mẫu vật đƣợc xử lý và bảo quản theo các phƣơng pháp riêng. Tất cả các lô mẫu vật nuôi theo gia đình đều đƣợc làm tiêu bản đồng bộ các giai đoạn trứng, bọ gậy, quăng và muỗi trƣởng thành.
Ngoài ra các bọ gậy đƣợc bắt từ các ổ tự nhiên cũng đƣợc chuyển về để nuôi cho nở thành muỗi, để phân loại (xác bọ gậy, quăng cũng đƣợc giữ lại để phân tích các dấu hiệu hình thái).
2.3.4.2. Phân loại muỗi dựa trên các dấu hiệu hình thái
Dấu hiệu hình thái từ pha trứng đến pha trƣởng thành đều đƣợc phân tích. Các dấu hiệu hình thái đƣợc định loại theo khóa phân loại của Viện Sốt rét – KST – CTTƢ (2008, 2010).
2.3.4.3. Điện di enzyme và phân tích kết quả điện di
Điện di trên gel cellulose acetate (Itan II, Helena Laboratories, U.K) theo phƣơng pháp của Smith và cs, 1996 [97].
Các hệ enzyme đƣợc nghiên cứu là:
- Glucose phosphate isomerase (GPI, E.C: 5.3.1.9) - Phosphate glucomutase (PGM, E.C: 2.7.5.1) - Isocitrate dehydrogenase (IDH, E.C: 1.1.1.42)
- 6- Phosphogluconate dehydrogenase (6- PGD, E.C: 1.1.1.44) - Glucose phosphate dehydrogenase (- GPD, E.C: 1.1.1.49) - Glutamate oxaloacetate transminase (GOT, E.C: 2.6.1.1)
Đây là một số hệ enzyme thƣờng đƣợc dùng trong xác định loài muỗi. - Tiến hành điện di: sử dụng bộ điện di HELENA tiến hành với điều kiện cƣờng độ dòng điện là 80mA. Bộ điện di đƣợc làm lạnh nhờ các tấm bọt biển lạnh. Thời gian điện di tuỳ thuộc vào từng loại enzyme.
40
- Nhuộm, phân biệt các enzyme: Sau khi điện di trên các gel khác nhau thu đƣợc các tiểu phần trên bản điện di không mầu. Muốn nhận biết phải dùng phƣơng pháp nhuộm đặc hiệu đối với từng loại enzyme. Thông thƣờng, muốn nhận biết một enzyme cũng nhƣ một isozyme nào đó ta cần có cơ chất tƣơng ứng, các coenzyme nhƣ: NAD, NADP, NADH…, các chất tạo mầu NBT, MTT, Fast Blue, Fast Garnet…và chất truyền điện tử PMS. Các dung dịch đệm thích hợp cho nhuộm mầu tuỳ theo các enzyme tƣơng ứng.
- Cách đọc kết quả điện di đƣợc mô tả chi tiết trong phần phụ lục 3 - Xử lý số liệu:
Sử dụng phần mềm TFPGA version 1.3 (Mark P. Miller, 1997) để xử lý các số liệu thu đƣợc. Xác định tần số alen: p = (2a + b) / (2N) q = (2c + b) / (2N) Trong đó: a: số cá thể đồng hợp theo A b: số cá thể dị hợp AA1 c: số cá thể đồng hợp theo A1 N: số cá thể nghiên cứu Kiểm định 2 2 = (O - E)2/E
Bậc tự do = số kiểu gen thu đƣợc – số alen Trong đó: O: tần số thực nghiệm
E: tần số lý thuyết
Hệ số tƣơng đồng di truyền (I): tính theo Nei (1972, 1978) xi.yi I = xi 2 . yi 2 .
41
Trong đó: xi là tần số alen thứ i của loài x yi là tần số alen thứ i của loài y
Khoảng cách di truyền (D) D = - ln I
2.3.4.4. Kỹ thuật ELISA xác định ký sinh trùng trong muỗi.
Kỹ thuật ELISA xác định ký sinh trùng trong muỗi đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp của Wirtz và cs, (1987). Bộ Kit ELISA của Plasmodium falciparum (P.f Mabs), Plasmodium vivax 210 (P.v 210 Mabs), Plasmodium vivax 247 (P.v 247 Mabs) đƣợc sử dụng trong thí nghiệm là do CDC Entomology Branch, Atlanta, Hoa Kỳ cung cấp. Các bƣớc tiến hành đƣợc mô tả chi tiết trong phần phụ lục 3.
2.3.4.5. Kỹ thuật PCR bán lồng đa mồi (semi nested multiplex PCR) xác định KST trong muỗi
Bảng 2.1. Trình tự mồi để xác định KST trong muỗi
Ký hiệu mồi Đặc hiệu loài Kích thƣớc sản phẩm PCR (bp) Trình tự
UNR Universal 5´-GAC GGT ATC TGA TCG TCT TC-3'
PLF Plasmodium 783-821 5´-AGT GTG TAT CAA TCG AGT TTC-3' FAR P.falciparum 395 5´-AGT TCC CCT AGA ATA GTT ACA -3' MAR P.malariae 269 5´-GCC CTC CAA TTG CCT TCT G-3'
OVR P.ovale 436 5´-GCA TAA GGA ATG CAA AGA ACA G-3' VIR P.vivax 499 5´-AGG ACT TCC AAG CCG AAG C-3'
42
Kiểm tra các mẫu ELISA dƣơng tính bằng kỹ thuật PCR bán lồng đa mồi theo Rubio J.M (2002) [91] để xác định 4 loài ký sinh trùng sốt rét.
* Tách chiết và tinh sạch ADN
Tách chiết, tinh sạch ADN bằng QIAamp DNA Micro Kit của hãng Qiagen theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất.
* Kỹ thuật PCR bán lồng đa mồi (semi nested multiplex PCR)
Phản ứng PCR để nhân bản gen đặc hiệu của giống Plasmodium gọi là Nested1. Các mồi đƣợc sử dụng cho phản ứng lần 1 và lần 2 có trình tự nhƣ ở bảng 2.1. Thành phần phản ứng đƣợc trình bày trong bảng 2.2.
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR lần 1 nhân bản đoạn gen chung của giống Plasmodium
Hóa chất Thể tích cho 1 đơn vị phản ứng( µl ) Nồng độ cuối cùng Qiagen 10X buffer 5 dNTP 0,5 200µM PLF 1 0.5pmol UNR 1 0.5pmol MilliQ 37,3
Taq polymerase 0,2 1 đơn vị
ADN mẫu 5
43
Chu trình nhiệt của phản ứng lần 1 là: 950
C- 5 phút. Sau đó là 40 chu kỳ 940C- 60 giây, 600C- 1 phút, 720C- 1 phút 30 giây, giữ ở 720C- 10 phút và cuối cùng giữ ở nhiệt độ 150
C.
Sản phẩm PCR lần một đƣợc pha loãng 500 lần và là khuôn cho phản ứng PCR đa mồi lần 2 để nhân bản đặc hiệu đoạn gen của 4 loài ký sinh trùng sốt rét. Thành phần của phản ứng PCR lần 2 đƣợc trình bày ở bảng 2.3.
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR đa mồi phát hiện 4 loài KST SR
Hóa chất Thể tích cho 1 đơn vị
phản ứng( µl ) Nồng độ cuối cùng Qiagen 10X buffer 2.5 dNTP 0,25 200 pmol/µl PLF 1 1pmol/µl FAR 1 0.6pmol/µl MAR 1 0.125pmol/µl VIR 1 0.1pmol/µl OVR 1 0.25pmol/µl MilliQ 15.05
Taq polymerase 0,2 1 đơn vị
ADN khuôn 2
Tổng thể tích 25
Kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di trên gel agarose 2% với điện thế 110V, điện áp 75mA với thời gian là 30 phút.
44
2.3.4.6. Tách chiết ADN của muỗi
Các mẫu có thể bảo quản khô ở nhiệt độ phòng hoặc ở -200C để tách chiết ADN. Tùy thuộc vào điều kiện của từng mẫu, ADN có thể thu đƣợc từ chân hoặc các phần khác của cơ thể (nhƣ cánh, đầu nhƣng không lấy phần bụng của con cái trƣởng thành). ADN đƣợc tách chiết theo REDExtract-N- AmpTM Tissue PCR Kit (Sigma) theo hƣớng dẫn của nhà sản suất có sửa đổi để tách chiết từ mô động vật. Dung dịch ADN đƣợc bảo quản ở 40C cho phản ứng PCR.
2.3.4.7. Kỹ thuật PCR nhân bản đoạn COI và ND6
Các dấu chuẩn phân tử và các mồi đƣợc lựa chọn theo Sallum và cộng sự (2007)[93].
Mồi để nhân bản một phần đoạn gen COI và ND6 có ký hiệu và trình tự đƣợc trình bày trong bảng 2.4.
Bảng 2.4. Trình tự mồi nhân bản đoạn COI và ND6
Ký hiệu mồi
Trình tự mồi Kích thƣớc
sản phẩm (bp)
UEA9.2 5'-CTA ACA TTT TTT CCT CAA CAT TTT TTA GG -3'
COI- 221bp (Không kể mồi)
UEA10.2 5'- TTA TTA TTA GTT AAT AAT AAY GGT ART TCT G-3'
ND6.F2 5'- TTG GWC GTA AWG GWC CAT AAA A -3' ND6-349bp (Không kể mồi)
ND6.R3 5'- CAR GAA TYT ATG TAA AAA CAT TTT G -3'
Điều kiện phản ứng PCR nhân bản đoạn gen COI: tổng thể tích phản ứng là 20μl gồm 2μl đệm 10x EXTaq (Takara, Nhật bản), 0,2 μM dNTPs,
45
0,5μM mồi UEA9.2, 1μM mồi UEA10.2, 0,1 μl EXTaq (Takara) và 1-2 μl ADN tách chiết.
Điều kiện phản ứng PCR nhân bản đoạn gen ND6 tƣơng tự nhƣ COI chỉ khác là sử dụng 1,0 μM mồi ND6F2 và ND6R3.
Chu trình nhiệt cho COI nhƣ sau: 5 chu kì: 30 giây ở 94°C, 30 giây ở 37°C và 30 giây ở 72°C, tiếp theo là 40 chu kì: 30 giây ở 94°C, 30 giây ở 47°C và 30 giây ở 72°C, cuối cùng là 2 phút ở 72°C.
Chu trình nhiệt cho ND6 là: 5 chu kì: 30 giây ở 94°C, 30 giây ở 37°C và 30 giây ở 72°C, tiếp theo là 45 chu kì: 30 giây ở 94°C, 30 giây ở 49°C và 30 giây ở 72°C, cuối cùng là 2 phút ở 72°C.
Sản phẩm PCR đƣợc phát hiện trên gel agarose 2% nhuộm ethidium bromide. Kích thƣớc các băng thu đƣợc đƣợc so sánh với thang ADN chuẩn.
2.3.4.8. Giải trình tự đoạn COI và ND6
Sản phẩm PCR thu đƣợc sau khi nhân bản đoạn COI và ND6 đƣợc tinh sạch bằng ExoSAP-IT (GE Healthcare Japan). Pha loãng ExoSAP-IT 10 lần với nƣớc khử ion, thêm 2μl dung dịch vừa pha loãng vào 5μl sản phẩm PCR, ủ ở 370C trong 30 phút và sau đó bất hoạt enzyme bằng cách ủ ở 800
C trong 15 phút. Các sản phẩm của phản ứng đƣợc tinh sạch bằng kết tủa cồn và hòa tan trong Formamide Hi-DiTM theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất và các trình tự này đƣợc xác định bằng máy giải trình tự ABI PRISM 3730.
2.3.4.9. Lập cây chủng loại phát sinh
Các phƣơng pháp kết nối liền kề (neighbor joining - NJ) và tiết kiệm tối đa (Maximum parasimony-MP) đƣợc thực hiện bằng phần mềm MEGA4. Tất cả các vị trí codon đƣợc tính đến và các vùng không rõ ràng đƣợc xem là dữ liệu thiếu. Các cây đƣợc tạo ra từ dữ liệu trên là cây có nguồn gốc sử dụng nhóm
46
đối chứng. Trong cây chủng loại phát sinh đƣợc xây dựng bằng phƣơng pháp NJ, khoảng cách tiến hóa đƣợc tính toán bằng phƣơng pháp Juked- Cantor. Để đánh giá độ tin cậy của cây chủng loại phát sinh xây dựng theo phƣơng pháp NJ, kiểm nghiệm Bootstrap và kiểm nghiệm nội nhánh (trong nhánh) đƣợc thực hiện với 2000 lần lặp lại. Ở cây chủng loại xây dựng theo phƣơng pháp MP, chiều dài nhánh đƣợc tính toán bằng phƣơng pháp đƣờng trung bình và đƣợc biểu hiện thông qua các đơn vị số lƣợng thay đổi trên toàn bộ trình tự.
2.3.4.10. Tạo chủng muỗi kháng với permethrin từ muỗi An. dirus chủng nuôi trong phòng thí nghiệm
Chủng muỗi nhạy An. dirus nuôi trong phòng thí nghiệm đƣợc coi nhƣ thế hệ F0. Thế hệ bọ gậy F1 và các thế hệ tiếp sau đó đƣợc coi là đối tƣợng để gây áp lực lựa chọn chủng kháng.
Hóa chất đƣợc sử dụng là permethrin 10,9 % hoạt chất (hãng Shell cung cấp).
Áp lực lựa chọn: để tạo chủng bọ gậy kháng, permethrin trƣớc hết đƣợc pha trong dung dịch cồn nguyên chất sau đó đƣợc hòa vào cốc nuôi bọ gậy có thể tích nƣớc là 250 ml. Mỗi một thế hệ thử nghiệm 5 nồng độ khác nhau. Những lô tạo ra tỷ lệ chết 50-70% thì đƣợc lựa chọn. Bọ gậy sống sót đƣợc nuôi sinh sản và tạo ra thế hệ sau và tiếp tục tạo áp lực lựa chọn với nồng độ cao hơn ở các thế hệ sau.
Bọ gậy thế hệ F1 và các thế hệ sau đƣợc tiến hành thử nghiệm sinh học theo tiêu chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới WHO/VBC/81.807 [111].
Chuẩn bị dung dịch hóa chất chuẩn trong cồn với nồng độ 1000mg/L. Mỗi lần thử nghiệm 5 nồng độ khác nhau trùng với nồng độ gây áp lực tạo chủng kháng. Mỗi nồng độ đƣợc lặp lại 4 lần (trong 4 cốc) và có một cốc đối
47
chứng không có hóa chất (Bảng phụ lục 4). Nồng độ nào tạo ra đƣợc tỷ lệ chết từ 50-70% thì tiếp tục đƣợc lặp lại ở thế hệ tiếp theo.
Thử nghiệm đƣợc tiến hành trong các cốc giấy có thể tích 300 ml. Pha hóa chất theo các nồng độ đã định vào 250 ml nƣớc nuôi bọ gậy sau 20 phút thì thả vào mỗi cốc 25 bọ gậy tuổi 4. Ghi nhận tỷ lệ bọ gậy chết sau khi tiếp xúc với hóa chất 24 giờ.
Không tính những bọ gậy nở thành quăng trong quá trình thí nghiệm, nếu có hơn 10% số bọ gậy nở thành quăng trong quá trình thí nghiệm thì phải loại bỏ kết quả, kết quả thử nghiệm cũng không đƣợc công nhận khi có hơn 20% số bọ gậy chết ở lô đối chứng.
Nếu tỷ lệ chết từ 5-20% thì điều chỉnh tỷ lệ chết theo công thức Abbott‟s:
% bọ gậy chết ở lô thí nghiệm - % bọ gậy chết ở lô đối chứng --- x 100
100 - % bọ gậy chết ở lô đối chứng
Tính liều lƣợng hóa chất gây chết 50% (LC50) ở từng thế hệ đƣợc lựa chọn.
Sau khi đạt đƣợc liều lƣợng gây chết 50% ổn định qua 3 thế hệ thì dừng áp lực lựa chọn. Thu thập muỗi ở thế hệ này để tiến hành các kỹ thuật sinh học phân tử phát hiện cơ chế kháng.
2.3.4.11. Thử nghiệm sinh học đối với muỗi trưởng thành thu thập từ thực địa.
Hai điểm tiến hành thu thập đủ mẫu muỗi để tiến hành thử nghiệm sinh học là xã Eachrang, Sơn Thành, Phú Yên và Đảo Lớn, Côn Đảo , Bà Rịa Vũng Tàu. Thử nghiệm sinh học đƣợc tiến hành theo tiêu chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới WHO/CDS/CDC/MAL/98.12 [110].
48
Muỗi cái mẹ bán chửa bắt từ thực địa, đem về phòng thí nghiệm, ép đẻ và nuôi thành muỗi trƣởng thành thế hệ F1.
Muỗi cái trƣởng thành thế hệ F1, 2-3 ngày tuổi chƣa đốt máu đƣợc sử dụng để tiến hành thử nghiệm sinh học.
Có 5 loại hóa chất đƣợc sử dụng để đánh giá độ nhạy cảm của muỗi với hóa chất là: permethrin 0,75%, DDT 4%, alpha-cypermethrin 30mg/m2
, lambda-cyhalothrin 0,05% và deltamethrin 0,05%. Các loại giấy thấm này đƣợc mua từ Trung tâm nghiên cứu phòng chống vector, Đại học Tổng hợp Sains, Malaysia.
Với mỗi loại hóa chất, có 4 lô muỗi thí nghiệm và 1 lô muỗi đối chứng. Mỗi lô muỗi đƣợc tiếp xúc với giấy tẩm hóa chất hoặc giấy đối chứng trong một ống thử dựng thẳng đứng trong vòng 1 giờ. Sau đó muỗi đƣợc chuyển sang ống nghỉ và cho hút nƣớc đƣờng gluco 10%. Tỷ lệ muỗi chết sẽ đƣợc ghi lại sau 24 giờ tiếp xúc.
Đánh giá kết quả thử nghiệm:
- Nếu tỷ lệ chết lớn hơn 98%- 100%: muỗi còn nhạy với hóa chất thử nghiệm.
- Nếu tỷ lệ muỗi chết từ 80-97%: Muỗi có khả năng kháng với hóa chất thử.
- Nếu tỷ lệ muỗi chết dƣới 80%: Muỗi đã kháng với hóa chất thử nghiệm.
- Nếu tỷ lệ muỗi chết từ 5-20% thì điều chỉnh tỷ lệ chết theo công thức Abbott‟s:
% muỗi chết ở lô thí nghiệm - % muỗi chết ở lô đối chứng
---x 100 100 - % muỗi chết ở lô đối chứng
49
- Nếu tỷ lệ muỗi ở lô đối chứng chết lớn hơn 20% thì hủy bỏ kết quả Bảo quản mẫu: Muỗi sống và chết ở ống thử nghiệm đƣợc giữ riêng trong các ống 1,5 ml với các nhãn giấy nhỏ, nhãn mầu xanh tƣợng trƣng cho muỗi bị chết và nhãn mầu đỏ tƣợng trƣng cho muỗi còn sống. Những mẫu muỗi này đƣợc giữ lạnh -20oC để sử dụng cho các nghiên cứu sinh học phân tử.
2.3.4.12. Kỹ thuật PCR-RFLP phát hiện đột biến kháng ngã gục (Kdr)
Sử dung kỹ thuật PCR-RFLP xác định đột biến điểm tại vị trí 1014L ở vùng DIIS6 trên gen mã hóa kênh vận chuyển Natri theo phƣơng pháp của Martinez –Torres và cs (1998) [73].
Trình tự mồi: Agd1: 5‟- ATA GAT TCC CCG ACC ATG – 3‟ Agd2: 5‟- AGA CAA GGA TGA GAA CC-3‟
Tổng thể tích phản ứng là 50l với các thành phần phản ứng có nồng