- Dị nguyờn D.pteronyssinus do khoa Miễn dịch Dị nguyờn, Bệnh viện Tai Mũi Họng Trung ương điều chế.
d. Cỏc phương phỏp xỏc định tớnh chất miễn dịch ♦ Gõy mẫn cảm trờn chuột lang
♦. Gõy mẫn cảm trờn chuột lang
Chuột lang khỏe mạnh, trọng lượng 250 - 300 g/con được chia làm 6 lụ (10 con/lụ): 1 lụ đối chứng tiờm dung dịch pha loóng DN; 5 lụ thớ nghiệm tiờm chế phẩm DN do chỳng tụi tỏch chiết,
Cỏch tiến hành: tiờm dưới da 4 lần, mỗi lần cỏch nhau 4 ngày với liều 0,5 ml (0,25 ml ở chõn trước, 0,25 ml ở chõn sau). Đến ngày 21, tiờm mũi cuối cựng với liều 1,5 ml DN nồng độ trờn, tiờm thẳng vào buồng tim.
Đỏnh giỏ kết quả tỡnh trạng chung và chỉ số sốc theo cỏc mức độ sau:
Mức độ Ký hiệu Biểu hiện
42 Sốc nhẹ (+) Chuột hơi run, khú thở nhẹ, lụng hơi dựng Sốc vừa (++) Khụng co giật, chỉ khú thở Sốc nặng (+++) Co giật, mất khả năng giữ thăng bằng, khụng chết Sốc rất nặng (++++) Chuột chết Chỉ số sốc (IS) tớnh theo cụng thức: A.X X: Số chuột chết IS =
Tổng số chuột thớ nghiệm A: Tổng số chuột sốc ở cỏc mức
(Trị số trung bỡnh của IS 3,2 - 3,5).
♦. Phản ứng phõn hủy tế bào mast
* Nguyờn lý: Dựa vào sự biến đổi hỡnh thỏi của tế bào mast dưới tỏc dụng của DN và KT IgE trong huyết thanh bệnh nhõn. Sau khi đó mẫn cảm, nếu DN lại xõm nhập vào cơ thể sẽ cú sự kết hợp DN với KT đặc hiệu gắn trờn màng tế bào mast. Phức hợp này làm tế bào mast bị phõn hủy.
Phản ứng nhằm mục đớch phỏt hiện KT dị ứng khỏng bụi nhà và MBN trong huyết thanh bệnh nhõn HPQ, VMDƯ hoặc huyết thanh động vật được gõy mẫn cảm bằng DNBN, DN MBN.
* Phương tiện - nguyờn vật liệu
- Dung dịch DN 10.000 PNU/ml
- Dung dịch nước muối sinh lý NaCl 0,9% - Huyết thanh bệnh nhõn
- Dung dịch nhuộm tế bào(xanh toludin0,1%;formaldehit10%;etanol 50%).
- Ete gõy mờ chuột * Dụng cụ:
- Bàn và dụng cụ mổ chuột, bụng, cồn, kim, bơm tiờm. - Ống nghiệm nhỏ, lam kớnh, buồng đếm bạch cầu. - Kớnh hiển vi thường, mỏy li tõm, tủấm 370 C. * Tiến hành:
43 - Cắt động mạch cho chảy hết mỏu.
- Tiờm 10 ml dung dịch NaCl 0,9% (370 C) vào ổ bụng chuột, day ổ
bụng 3-5 phỳt.
- Mổ bụng chuột, hỳt hết dịch đó bơm vào ổ bụng chuột cho vào ống nghiệm đỏy trũn.
- Li tõm 1000 v/p trong 5 phỳt.
- Bỏ phần dịch nổi, lấy tủa. Bổ sung vào dịch treo 1 ml NaCl 0,9%. Lấy 3 ống nghiệm đỏnh số 1,2,3. Nhỏ vào mỗi ống 50 àl cỏc dung dịch sau:
Dịch thớ nghiệm (ốỐng TN) ng 1 (chỐứng DN) ng 2 (chỐứng 3 ng HT)
Dịch treo tế bào 50 àl 50 àl 50 àl
Dị nguyờn 50 àl 50 àl
Huyết thanh bệnh nhõn 50 àl 50 àl
Ủ cỏc ống nghiệm ở 370 C trong 15 phỳt. Nhuộm tế bào bằng xanh toludin và đọc kết quả.
Đọc kết quả phản ứng phõn hủy tế bào mast theo cỏc mức độ sau:
Mức độ Ký hiệu Biểu hiện Âm tớnh - Tỉ lệ tế bào vỡ ≤ 10% Dương tớnh nhẹ + Tỉ lệ tế bào vỡ 11-20% Dương tớnh vừa ++ Tỉ lệ tế bào vỡ 21-30% Dương tớnh mạnh +++ Tỉ lệ tế bào vỡ 31-40% Dương tớnh rất mạnh ++++ Tỉ lệ tế bào vỡ > 40% ♦. Phản ứng tiờu bạch cầu đặc hiệu Trong cỏc phản ứng dị ứng, phức hợp DN - khỏng thể khụng những chỉ
làm phõn huỷ tế bào mastocyte, mà cũn phỏ huỷ tế bào bạch cầu hạt. Vỡ vậy, nhiều tỏc giả đó nghiờn cứu và sử dụng phản ứng này để gúp phần trong chẩn
đoỏn đặc hiệu bệnh dị ứng. Thường sử dụng là cỏc tỏc giả X.M. Tilova; A.A. Polner; T.L.Xerova .
44
Xột nghiệm này được tiến hành tại la-bụ của Viện Y học biển Việt Nam. * Nguyờn lý:
Phức hợp DN - khỏng thể gắn ở màng tế bào bạch cầu hạt khi cú tỏc
động của bổ thể sẽ làm phõn huỷ bạch cầu hạt.
* Phương tiện - dụng cụ: (theo phương phỏp X.M. Tilova. 1971). * Tiến hành:
- Bước 1: Lấy 2 ống nghiệm: ổng thử (a) và ống chứng (b). Cho vào như sau:
Dịch thớ nghiệm Ống thử (a) Ống chứng (b)
Citrate natri 3,8% 0,05 ml 0,05 ml
Mỏu bệnh nhõn 0,1 ml 0,1 ml
NaCl 0,9% - 0,05 ml
Dị nguyờn D.pt 0,05 ml -
- Bước 2: Để cả hai ống nghiệm ở tủấm 370C trong 2 giờ, cứ 15 phỳt lắc nhẹ một lần.
- Bước 3: Dựng micropipette hỳt ở ống thử và ống chứng, mỗi ống 0,02ml, cho sang hai ống nghiệm khỏc đó đỏnh dấu (a’, b’) rồi thờm vào mỗi
ống 0,4ml dung dịch axit acetic 3% để phỏ vỡ hồng cầu. Tớnh chỉ số bạch cầu (CSBC) đặc hiệu theo cụng thức: Bk - Bo CSBC = Bk x 100% BK: Số bạch cầu đếm được ởống chứng. B0: Số bạch cầu đếm được ởống thớ nghiệm.
Phản ứng được coi là dương tớnh khi chỉ số tiờu bạch cầu đặc hiệu từ
10% trở lờn. Cú thể chia thành từng mức độ phản ứng như sau: Dương tớnh 1 (+) nếu chỉ số tiờu bạch cầu từ 10% - 20%. Dương tớnh 2 (+) nếu chỉ số tiờu bạch cầu từ 21% - 300%. Dương tớnh 3 (+) nếu chỉ số tiờu bạch cầu từ 31% - 40%. Dương tớnh 4 (+) nếu chỉ số tiờu bạch cầu trờn 40%.
45
♦. Test lẩy da ( Prick test)
Được tiến hành theo kỹ thuật của T.J.Sullivan (1981): Làm sạch mặt da vựng trước cẳng tay bằng cồn 700, để khụ, rồi lần lượt nhỏ lờn mặt da ở cỏc vị
trớ cỏch nhau 3-4cm, mỗi chỗ một giọt cỏc dụng dịch chứng và thử. - NaCl 0,9%.
- Histamin 0,01%
- Dung dịch DN D.pteronyssinus nồng độ 1000 PNU/ml.
Dựng kim xuyờn qua giọt dung dịch cắm nhẹ vào mặt da qua lớp thượng bỡ (khụng chảy mỏu) tạo một gúc 450 rồi lẩy nhẹ lờn (mỗi giọt dựng một kim lẩy da riờng), đợt 3-5 phỳt sau dựng bụng thấm ở rỡa giọt dung dịch cho khụ hết. Đọc kết quả sau 15-20 phỳt. Bảng 2.1. Đỏnh giỏ mức phản ứng của test lẩy da Biểu hiện Ký hiệu Đường kớnh sẩn Biểu hiện khỏc Âm tớnh - 1 mm Giống chứng õm Nghi ngờ ± < 3mm Ngứa nhẹ chỗ tiờm Dương tớnh nhẹ + 3 - 5mm Ngứa, cú ban đỏ
Dương tớnh vừa ++ 6 - 8mm Ngứa, ban đỏ, xung huyết rộng Dương tớnh mạnh +++ 9 – 12mm Giống (++), cú thờm chõn giả
Dương tớnh rất mạnh ++++ > 12mm Ngứa, ban đỏ, xung huyết rộng, nhiều chõn giả
♦. Khỏm chọn bệnh nhõn
Đối tượng: Cỏc bệnh nhõn HPQ atopy, VMDƯ, viờm kết mạc mựa xuõn, mày đay ở Khoa Dịứng - Miễn dịch lõm sàng Bệnh viện Tai Mũi Họng được thăm khỏm theo mẫu 25 của WHO.
46 Khai thỏc tiền sử dị ứng dựa theo:
+ Mẫu 25B của WHO về hỏi tiền sử dị ứng (xem phần phụ lục).
+ Mẫu cõu hỏi chi tiết cú tớnh điểm của ISAAC (International study of allergy and asthma childhood, 1994).
Việc khỏm lõm sàng và tớnh điểm, chỳng tụi dựa theo mẫu:
+ Thang cho điểm đỏnh giỏ cỏc triệu chứng mũi của Bent Weeke và Niels Mygind Đan Mạch, 1985.
+ Bảng cõu hỏi đỏnh giỏ triệu chứng mũi của bệnh đường hụ hấp (phần mũi) được coppy từ bộ cõu hỏi của Institude of occupational medicine trong British Journal of Industrial Medicine 1988 (xem phụ lục). + Một số cõu hỏi chi tiết về lõm sàng được xem xột và bổ sung.
Dựa vào toàn bộ cỏc tài liệu trờn, chỳng tụi xõy dựng được bảng tớnh điểm cho tiền sử dịứng và khỏm lõm sàng của VMDƯ, được túm tắt dưới đõy.
* Khai thỏc tiền sử dị ứng * Tiền sử dị ứng gia đỡnh Bố Nếu cú 2 điểm Mẹ Nếu cú 2 điểm Anh chị em ruột Nếu cú 2 điểm Họ bờn bố Nếu cú 1 điểm Họ bờn mẹ Nếu cú 1 điểm * Tiền sử dị ứng bản thõn, cú cỏc bệnh tỏi diễn Chàm dịứng, eczema Nếu cú 2 điểm Viờm mũi dị ứng Nếu cú 2 điểm Hen phế quản Nếu cú 2 điểm Mày đay sẩn ngứa Nếu cú 1 điểm
47
Dị ứng thuốc Nếu cú 1 điểm Dị ứng thức ăn Nếu cú 1 điểm
Phự Quincke (phự mặt, mụi) Nếu cú 1 điểm Tiền sửđược nghi ngờ là cú dị ứng rừ khi cộng từ 8 điểm trở lờn.
* Biểu hiện lõm sàng * Chủ quan: Cú cỏc biểu hiện thường gặp - Ngứa mũi thường xuyờn Nếu cú 2 điểm - Hắt hơi thường xuyờn Nếu cú 2 điểm - Chảy mũi trong Nếu cú 2 điểm - Ngạt mũi từng đợt Nếu cú 1 điểm - Ho, ngứa họng thường xuyờn Nếu cú 1 điểm - Đỏ, ngứa mắt từng đợt Nếu cú 1 điểm - Phản ứng mũi ở nơi làm việc (biểu hiện rừ hơn khi ở nhà hoặc khi được nghỉ làm) Nếu cú 4 điểm * Khỏm - Niờm mạc mũi nhợt nhạt 2 điểm - Phự nề cỏc cuốn và niờm mạc mũi 2 điểm - Polype mũi 1 điểm - Đọng nhiều dịch nhầy mũi 1 điểm - Cuốn dưới quỏ phỏt 1 điểm
- Viờm họng, viờm amidan mạn tớnh 1 điểm
48
Từ việc khai thỏc tiền sử, khỏm lõm sàng cú tớnh điểm, những bệnh nhõn VMDƯđược lựa chọn là những bệnh nhõn cú tổng sốđiểm đạt 16 trở lờn.
* Khỏm toàn diện:
Những bệnh nhõn đạt 16 điểm trở lờn được chọn, sẽđược khỏm đa khoa toàn thểđể nhằm loại trừ cỏc bệnh chuyờn khoa khỏc. Từđú chọn ra được nhúm bệnh nhõn nghiờn cứu. Nhúm chứng cũng đồng thời được khỏm để xỏc
định khụng mắc bệnh VMDƯ và khụng mắc bệnh gỡ khỏc được thử prick-test với DN D.pteronyssinus cú nồng độ 1000 PNU .