- Dị nguyờn D.pteronyssinus do khoa Miễn dịch Dị nguyờn, Bệnh viện Tai Mũi Họng Trung ương điều chế.
c. Phản ứng phân huỷ tế bào Mast
3.5.2.3. Đặc tính sinh học của dị nguyên D.pteronyssinus
Để chế phẩm dị nguyên đ−ợc tách chiết có thể dùng cho ng−ời thì việc xác định các chỉ tiêu sinh học là không thể thiếu, bất kỳ một chất nào đ−ợc đ−a vào cơ thể đều cần có điều kiện cần và đủ là vô trùng, ít độc, thải trừ nhanh, không tích luỹ và đạt hiệu quả mong muốn của mục đích dùng. Xuất phát từ quan điểm đó, chúng tôi đã xác định các đặc tính sinh học của dị nguyên D. pteronyssinus đã tách chiết.
+ Về độ vô trùng
Nhằm mục đích kiểm tra chế phẩm có đủ tiêu chuẩn về mặt vô trùng hay không, chúng tôi tiến hành cấy dị nguyên trên các môi tr−ờng phù hợp từng loại vi khuẩn hiếu khí, kỵ khí, nấm. Kết quả ở trên cho thấy tất cả các mẫu đều không nhiễm khuẩn, nhiễm nấm. (bảng 3.5)
Theo tiêu chuẩn của D−ợc điển Việt Nam, chế phẩm dị nguyên D.
pteronyssinus của chúng tôi hoàn toàn vô trùng.[2]
+ Về độ an toàn
Qua thử nghiệm, chúng tôi thấy chế phẩm dị nguyên D. pteronyssinus đạt tiêu chuẩn độ an toàn theo cách thử của vacxin [2]. Sau 10 ngày theo dõi ở cả 3 lô thử không có chuột nào chết. Sự thay đổi trọng l−ợng chuột cũng phù hợp với yêu cầu về thử độ an toàn.(bảng 3.6)
74
So sánh bằng test “tr−ớc – sau” thấy sự thay đổi trọng l−ợng chuột tr−ớc và sau khi tiêm chế phẩm dị nguyên mạt có tăng: sau 5 ngày trọng l−ợng trung bình của chuột tăng song không có ý nghĩa thống kê (p>0,05); sau 10 ngày trọng l−ợng trung bình của chuột ở cả 3 lô đều tăng so với lô chứng. Sự tăng này có ý nghĩa thống kê (p < 0,05).
Tuy nhiên, ở cả 3 lô sau khi tiêm 1 – 2 phút đều thấy có hiện t−ợng run nhẹ, c−ờng độ run và thời gian run gần giống nhau ở cả 3 lô. Điều đáng l−u ý là cả lô tiêm dung môi dị nguyên cũng có hiện t−ợng đó chứng tỏ triệu chứng này do dung môi gây ra.
+ Về độc tính cấp
Tr−ớc khi sử dụng dịch chiết dị nguyên trong y học chúng ta phải kiểm tra độ độc của chúng. Sự khác nhau giữa liều điều trị và liều độc càng lớn thì độ an toàn của chế phẩm càng cao. Kiểm tra độ độc đ−ợc tiến hành trên chuột nhắt trắng tr−ởng thành khối l−ợng 15 – 20 g/con theo ph−ơng pháp mô tả trong D−ợc điển Việt Nam. Kết quả thử độc tính cấp ở bảng 3.7 cho thấy.
Liều dùng lớn nhất một lần trên ng−ời là 0,5ml dung dịch 1/500 t−ơng đ−ơng với 0,0002 mg/kg thể trọng (tính trung bình ng−ời nặng 50kg). Tiêm chuột dùng tới liều 80mg/kg cân nặng mà không thấy chuột nào chết. Liều này lớn hơn liều dùng thông th−ờng 400 lần, điều đó chứng tỏ chế phẩm dị nguyên D. pteronyssinus đ−ợc tách chiết có độc tính cấp rất thấp, do đó chúng tôi không thử liều chết LD50.
3.5.2.4. Đặc tính miễn dịch của dị nguyên D. pteronyssinus
+ Gây mẫn cảm chuột lang
Chúng tôi tiến hành gây sốc phản vệ ở chuột lang bằng chế phẩm dị nguyên D. pteronyssinus. Kết quả ở bảng 3.8 cho thấy khi đ−a dị nguyên với liều quyết định 1/500, tiêm thẳng vào buồng tim đã gây sốc phản vệ rõ rệt trong nhóm động vật thí nghiệm. Chỉ số sốc trung bình cho 3 lô thử nghiệm đầu bằng dịch chiết là 3.; 2 lô thử nghiệm sau bằng các phân đoạn là 3,15 so
75
với nhóm chứng có chỉ số sốc = 0. So với chỉ số sốc tiêu chuẩn là 3,2 đến 3,5 kết quả của chúng tôi nằm trong vùng tiêu chuẩn Không tr−ờng hợp nào khi đ−a dị nguyên D. pteronyssinus vào mà không bị sốc, chỉ khác nhau ở mức độ.
+ Test lẩy da
Test lẩy da là ph−ơng pháp đơn giản nhất, đ−ợc sử dụng rộng rãi nhất để kiểm tra hoạt tính in vivo của dịch chiết dị nguyên. Ph−ơng pháp này dựa trên vùng da của những bệnh nhân tình nguyện bị dị ứng với dị nguyên đ−ợc nghiên cứu. Vấn đề chủ yếu của thử nghiệm da là lựa chọn bệnh nhân. Nhóm bệnh nhân này cần phải đại diện cho quần thể bệnh nhân dị ứng trung bình và cần đ−ợc xác định thêm bằng các ph−ơng pháp khác.
Trong xét nghiệm cơ bản test lẩy da đ−ợc thực hiện đầu tiên để chẩn đoán dị ứng. Kết quả của test lẩy da là một căn cứ quan trọng cho kế hoạch chẩn đoán và điều trị đặc hiệu bệnh dị ứng.[1]
Làm test da trực tiếp những đối t−ợng dị ứng là ph−ơng pháp in vivo chính để đánh giá hiệu năng chiết xuất dị nguyên. Không thực tế nếu sử dụng test in vivo nh− một thí nghiệm thông dụng hàng ngày cho các lô sản xuất; tuy nhiên có thể so sánh các lô sản xuất bằng các ph−ơng pháp in vitro thích hợp với các chiết xuất tham khảo nội bộ có hoạt tính in vivo đã đ−ợc chứng minh. Các tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân cho các thí nghiệm in vivo rất quan trọng vì tất cả các ph−ơng pháp in vivo cuối cùng sẽ phụ thuộc vào nhóm bệnh nhân lựa chọn.[1, 37].
Làm test da ở ng−ời là nguyên lý cơ sở cho việc thiết lập các đơn vị sinh học của hiệu năng chiết xuất dị nguyên. Một số đơn vị sinh học đ−ợc sử dụng. Ở Châu Âu, đơn vị hiệu năng dựa trên liều dị nguyên gây ra một nốt sần t−ơng đ−ơng kích th−ớc nốt sần tạo ra bởi một nồng độ nhất định histamin. Đơn vị này ban đầu gọi là hiệu năng t−ơng đ−ơng histamin
76
(histamine equivalent potency- HEP). Các chỉ dẫn Bắc  u đã đ−a ra đơn vị sinh học (biological unit- BU), 1000 BU bằng 1 HEP. [1, 92, 98]
Nghiên cứu của Petrova (1987) cho thấy trong số 81 bệnh nhân HPQ và VMDƯ 88,9% có phản ứng d−ơng tính với dị nguyên D. pteronyssinus. Kết quả test lẩy da với dị nguyên D. pteronyssinus của Vũ Minh Thục (1995) là 71,4% cho phản ứng d−ơng tính, trong số đó mức độ (+) 35,0%; (++) 42,5%; (+++) 22,5%. Kết quả của Trịnh Mạnh Hùng (2002) là 71,9% d−ơng tính với dị nguyên D. pteronyssinus trong số 171 bệnh nhân dị ứng, 47% có mức độ d−ơng tính (+).
Tiến hành test lẩy da cho 270 bệnh nhân dị ứng và 80 ng−ời khỏe, chúng tôi nhận thấy mức độ mẫn cảm với cả 4 loại dị nguyên ở nhóm chứng và nhóm bệnh nhân khác nhau rõ rệt cả về tỉ lệ test d−ơng tính lẫn đ−ờng kính ban sẩn (bảng 3.9 ; 3.10) .
Tỉ lệ test lẩy da d−ơng tính với dị nguyên D. pteronyssinus do chúng tôi tách chiết ở nhóm bệnh nhân: 72,96 % so với nhóm chứng 6%; với dị nguyên
D. pteronyssinus của Pháp: 69,63% và 6%; với dị nguyên D. pteronyssinus
của Trung quốc: 74,81% và 6% ; dị nguyên bụi nhà 61,1% . Đ−ờng kính ban sẩn trung bình ở nhóm bệnh nhân từ 5,2 mm đến 6,9 mm, so với nhóm chứng 3,3 mm đến 3,5 mm. Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê (p<0,001). Kết quả này của chúng tôi phù hợp với tỉ lệ test lẩy da d−ơng tính của Vũ Minh Thục (1995) và Trịnh Mạnh Hùng (2002).
Tỉ lệ phản ứng da d−ơng tính với dị nguyên D. pteronyssinus do chúng tôi tách chiết (72,96%) cao hơn dị nguyên bụi nhà (61,1%) và dị nguyên D.
pteronyssinus của Pháp (69,63%), thấp hơn so với dị nguyên D. pteronyssinus
của Trung quốc (74,81) song sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).
Đ−ờng kính ban sẩn trung bình của test lẩy da với chế phẩm dị nguyên của chúng tôi (6,8 ± 1,4 mm) cao hơn so với dị nguyên bụi nhà (5,2 ± 1,6 mm) và dị nguyên D. pteronyssinus của Pháp (6,6 ± 1,9 ), thấp hơn so với dị
77
nguyên D. pteronyssinus của Trung quốc (6,9 ± 1,9 mm), t−ơng đ−ơng với mức độ d−ơng tính (++) và (+++), song sự cao hơn hay thấp hơn không có ý nghĩa thống kê (với p > 0,05).
Trong nhóm chứng gồm những ng−ời khỏe mạnh thấy có 3 ng−ời cho kết quả d−ơng tính với chế phẩm dị nguyên D. pteronyssinus, điều đó chứng tỏ một số ng−ời khỏe vẫn có khả năng mẫn cảm tiềm ẩn với dị nguyên mạt.
Xét về mức độ phản ứng d−ơng tính của test lẩy da với chế phẩm dị nguyên D. pteronyssinus do chúng tôi tách chiết thì kết quả tập trung chủ yếu ở các mức độ (++) và (+++). Kết quả t−ơng tự cũng thu đ−ợc đối với dị nguyên bụi nhà, dị nguyên D. pteronyssinus của Pháp và dị nguyên D.
pteronyssinus của Trung quốc (bảng 3.10). Mức độ (++) và (+++) của các dị
nguyên nh− sau: D. pteronyssinus do chúng tôi tách chiết 41,6% và 27,4%; dị nguyên D. pteronyssinus của Pháp 41,5% và 27,1%; dị nguyên D. pteronyssinus của Trung quốc là 42,1% và 27,2%; dị nguyên bụi nhà 41,2% và 28,5%. Xét về mức độ d−ơng tính của test lẩy da giữa 4 dị nguyên không có sự khác biệt lớn, tuy vậy có nhận xét rằng hoạt tính của chế phẩm dị nguyên D. pteronyssinus do chúng tôi tách chiết cao hơn so với dị nguyên bụi nhà, với dị nguyên D. pteronyssinus của Pháp và thấp hơn dị nguyên D.
pteronyssinus của Trung quốc,song sự cao hơn hay thấp hơn không có ý nghĩa
thống kê (với p > 0,05).
+ Kết quả xét nghiệm phân huỷ mastocyte ở bệnh nhân
Đây là ph−ơng pháp gián tiếp định l−ợng IgE đặc hiệu. Phản ứng tiến hành đơn giản, ít tốn kém và còn giá trị để chẩn đoán bệnh dị ứng nói chung .
ở các n−ớc tiên tiến, ph−ơng pháp này rất hiếm đ−ợc sử dụng. Thay vào đó là các ph−ơng pháp định l−ợng trực tiếp kháng thể IgE đặc hiệu trong huyết thanh BN. ở n−ớc ta, điều kiện trang thiết bị không cho phép nên phản ứng
78
phân huỷ mastocyte vẫn là một ph−ơng pháp chẩn đoán dị ứng ở các cơ sở điều trị miễn dịch dị ứng.
Kết quả của phản ứng đ−ợc đánh giá theo tỷ lệ phần trăm. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi trên nhóm VMDƯ có 320 bệnh nhân, nhóm chứng 80 bệnh nhân, thấy rằng ở nhóm chứng tỷ lệ d−ơng tính chiếm 11,25 % trong khi đó nhóm VMDƯ chiếm tỷ lệ 92,8%. Có sự sai khác tỷ lệ phân huỷ mastocyte ở 2 nhóm khá rõ rệt. Sự khác nhau này có ý nghĩa thống kê (p < 0,001). Và số bệnh nhân có mức độ phản ứng d−ơng tính, mức độ phân huỷ tế bào Mast thấp nhất là 14 %, cao nhất là 70%.(bảng 3.11; 3.12)
Theo cách đánh giá đó, kết quả của Petrova (1987) là 63,7 ± 2,79% số mẫu có phản ứng d−ơng tính, trong đó mức độ (++) là chủ yếu (46,8%).
Theo Poriadin (1999), khi nghiên cứu một số chỉ số hóa học, sinh học của dị nguyên toàn phần, 4 phân đoạn thu đ−ợc bằng lọc gel trên sephdex G- 15, G-25, gel Toyopearl HW-60 (hãng Toyocoda San, Japan) và dị nguyên đ−ợc tinh chế bằng thấm tách, tác giả nhận thấy rằng số phản ứng d−ơng tính trong phản ứng phân hủy tế bào mast là 67,1 ± 2,31%, mức độ phân hủy nằm trong giới hạn kiểm tra của thí nghiệm (tỉ lệ phân hủy tế bào mast của dị nguyên toàn phần và dị nguyên đ−ợc thấm tách 26,06 ± 0,71% và 26,52 ± 1,93%, của 4 phân đoạn còn lại từ 19,57 ± 1,32% đến 5,64 ± 1,44%).
Nghiên cứu của Trịnh Mạnh Hùng (2002) cho thấy tỉ lệ phản ứng phân hủy tế bào mast d−ơng tính đối với dị nguyên D. pteronyssinus là 66,67%. Phần lớn các tr−ờng hợp cho phản ứng d−ơng tính với mức độ từ (++) và (+++).
Trong nghiên cứu của chúng tôi, tỉ lệ phân hủy trung bình của tế bào mast đối với dị nguyên mạt đạt 31,4 ± 10,8%, trong đó mức độ (++) chiếm 31,6%; mức độ (+++) 33,7% trên tổng số bệnh nhân xét nghiệm.
Kết quả của chúng tôi về tỉ lệ d−ơng tính trong phản ứng này gần t−ơng đ−ơng với kết quả của Petrova (1987) và phù hợp với kết quả của Trịnh Mạnh
79
Hùng (2002), Nguyễn Thị Vân (1996). Nguyễn Thị Vân cũng cho thấy tỉ lệ d−ơng tính của ng−ời bệnh HPQ với DNBN và mạt bụi nhà (MBN) D.
pteronyssinus trong phản ứng này khá cao, từ 86,94% - 86,99%, mức độ d−ơng tính th−ờng ở mức (++) và (+++). Về mức độ phân hủy của tế bào mast, kết quả của chúng tôi t−ơng đ−ơng với kết quả của Poriadin đối với dị nguyên toàn phần và dị nguyên đ−ợc thấm tách và kết quả của các tác giả trên.
+ Kết quả xét nghiệm tiêu bạch cầu đặc hiệu ở bệnh nhân
Phản ứng tiêu bạch cầu đặc hiệu đ−ợc tiến hành trên 2 nhóm: nhóm chứng và nhóm bệnh nhân. Nhóm chứng gồm 80 ng−ời khoẻ mạnh và nhóm bệnh nhân gồm 320 bệnh nhân VMDƯ.
Kết quả cho thấy ở nhóm chứng tỷ lệ d−ơng tính chiếm 8.75%. ở nhóm VMDƯ mức độ d−ơng tính chiếm 92,8 %.
Tỷ lệ tiêu huỷ bạch cầu ở 2 nhóm: nhóm chứng và nhóm bệnh nhân khác nhau có ý nghĩa thống kê (p < 0,001).
Và số bệnh nhân có mức độ tiêu bạch cầu đặc hiệu thấp nhất là 15 %, cao nhất là 64%.
Trong nghiên cứu của chúng tôi, tỉ lệ tiêu bạch cầu đặc hiệu trung bình đối với dị nguyên mạt đạt 30,4 ± 11,6%, trong đó mức độ (++) chiếm 37,4%; mức độ (+++) 26,3% trên tổng số bệnh nhân xét nghiệm.