- Kỹ thuật hóa mô miễn dịch (HMMD): dựa trên hệ phương pháp ABC (Biotin Avidin Complex) Đây là một kỹ thuật cao có sử dụng kháng
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.2. Cách thức tiến hành nghiên cứu:
2.2.2.1. Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng
Nghiên cứu hồ sơ bệnh án về các đặc điểm lâm sàng như tuổi, giới, tiền sử , thời gian phát hiện bệnh, triệu chứng lâm sàng,…
2.2.2.2. Nhận định hình ảnh nội soi UTDD
Tất cả bệnh nhân trong mẫu nghiên cứu đều được nội soi dạ dày tá tràng bằng máy nội soi Olympus (Evis EXERA CLV–160) và Pentax (EPK–I) tại Trung tâm Nội soi can thiệp Bệnh Viện Đại Học Y Hà Nội.
Với UTDD sớm chúng tôi áp dụng phân loại của Hiệp hội nội soi tiêu hóa Nhật Bản (dạng trợt nông, dạng phẳng, dạng polyp), với UTDD muộn chúng tôi áp dụng phân loại của Borrman.
\
Hình 2.1 Hình ảnh UTDD theo phân loại của Borrman
BORRMAN I
BORRMAN II
BORRMAN III
2.2.2.3. Nghiên cứu đặc điểm mô bệnh học
Các bệnh phẩm khối u dạ dày sau sinh thiết qua nội soi được cố định bằng formon trung tính 10%, chuyển đúc trong paraffin.Tất cả các khối nến (paraffin) được cắt bằng máy có độ dày 3–4µm và tiến hành nhuộm tiêu bản theo phương pháp H.E. Các tiêu bản được đọc và đánh giá theo các tiêu chí:
- Phân loại vi thể: Chúng tôi áp dụng phân loại vi thể khối u dạ dày theo phân loại của Tổ chức Y tế Thế giới năm 2000 và theo phân loại của Lauren năm 1965.
- Chúng tôi xếp độ biệt hóa mô học đối với UTBM tuyến ống dạ dày.
2.2.2.4. Xét nghiệm định lượng chất chỉđiểm khối u
Tất cả bệnh nhân trong mẫu nghiên cứu được làm xét nghiệm định lượng nồng độ CEA, CA 19–9 và CA72–4 trong huyết thanh.
Các mẫu huyết thanh được tiến hành định lượng bằng kỹ thuật điện hóa phát quang (The Electrochemiluminesece Immunoassay–ECLIA) trên máy
Cobas e 411của hãng Hitachi tại Labo xét nghiệm Bệnh viện Đại Học Y Hà
Nội.
2.2.2.5. Nghiên cứu bộc lộ Bcl–2 theo phương pháp HMMD
Tất cả mẫu bệnh phẩm nghiên cứu Bcl–2 được làm MBH và HMMD tại Bộ môn Giải Phẫu Bệnh Trường ĐH Y Hà Nội. Bệnh phẩm được nhuộm HMMD với kháng thể đơn dòng Bcl–2, sử dụng kỹ thuật Biotin–Avidin Complex (ABC), đánh giá sự bộc lộ protein Bcl–2.
Các bước tiến hành xét nghiệm HMMD
- B1: Bệnh phẩm được cắt dày 3–4µm, dàn trên các lam kính phủ Silane - B2: Ủ qua đêm ở nhiệt độ 420C
- B3: Tẩy nến bằng Toluen và cồn như nhuộm thông thường - B4: Rửa nước cất x 5 phút
- B5: Bộc lộ kháng nguyên bằng nhiệt: đặt tiêu bản trong dung dịch citrate nồng độ 0,01 mol/l, pH = 6,0, đun sôi trong nồi áp xuất x 5 phút.
- B6: Rửa nước x 5 phút
- B7: Khử peroixidase nội sinh bằng H202 x 10 phút - B8: Rửa nước x 5 phút - B9: Ủ kháng thể thứ nhất 1 giờ - B10: Rửa TBS 3 lần, mỗi lần 5 phút - B11: Ủ kháng thể thứ hai 30 phút - B12: Rửa TBS 3 lần, mỗi lần 5 phút - B13: Phủ ABC x 30 phút - B14: Rửa TBS 3 lần, mỗi lần 5 phút - B15: Ủ với DAB x 10 phút
- B16: Rửa nước chảy x 5 phút
- B17: Nhuộm nhân với Hematoxylin x 30 giây, rửa nước chảy vài phút - B18: Tẩy nước, làm trong và gắn lamen
Tất cả các tiêu bản được tiến hành nghiên cứu trên KHVQH ở các độ phóng đại khác nhau do các chuyên gia giải phẫu bệnh có kinh nghiệm kiểm định:
- Biểu hiện dương tính khi nhân tế bào có màu vàng nâu còn kết quả âm tính khi nhân tế bào không bắt màu vàng nâu.
- Phản ứng dương tính nếu trên 10% nhân tế bào bắt màu với cường độ đủ nhận thấy dưới KHVQH.