ĐƢỢC DÙNG CHẾ TẠO CHẾ PHẨM
3.1.1. Kết quả phân lập và định lượng acid lactic của các chủng Lactobacillus phân lập được.
3.1.1.1.Kết quả phân lập các chủng Lactobacillus
Dựa vào đặc điểm của vi khuẩn Lactobacillus, chúng tôi đã sử dụng môi
trƣờng MRS bổ sung CaCO3 0,5%, nuôi 24 - 48 giờ ở nhiệt độ 370
C, có 5% CO2 chỉ giữ lại các khuẩn lạc trên đĩa thạch xung quanh có vòng trong suốt. Kết quả phân lập trình bày tại bảng 3.1.
Bảng 3.1.Một số đặc điểm sinh học của các chủng Lactobacillus phân lập được
Tên mẫu Ký hiệu mẫu Đặc điểm Tên mẫu Ký hiệu mẫu Đặc điểm Nhuộm Gram Phản ứng Catalaza Di động Nhuộm Gram Phản ứng catalaza Di động Nem chua (Chợ Thái) NC1 + - - Mắm tôm MT1 + - - NC2 + - - MT2 + + - Bắp cải lên men BC + - - MT3 - - - Bã bia (Vicoba) BB1 - - - MT4 - - + BB2 + - - Nƣớc muối dƣa ND1 + ± - BB3 + - - ND2 + - - Bã sắn NS1 + - - Nƣớc ép quả lên men NQ1 + - - NS2 + - - NQ2 + - - NS3 + - - NQ3 + - + Nƣớc cà muối CM1 + + + Mẻ chua M1 + - + CM2 - - ± M2 + - - CM3 + - - Nem chua (Tân Thịnh) TL4 + - -
Chú thích: +: dương tính, -: âm tính, ± không xác định
Formatted: Font color: Black
Formatted: Font color: Black, English (U.S.)
Formatted: Font: 14 pt, Font color: Black
Formatted: Font: 14 pt, Font color: Black, English (U.S.)
Formatted: Font color: Black, English (U.S.)
Formatted: Font color: Black, English (U.S.)
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy từ 10 sản phẩm lên men thu thập tại khu vực thành phố Thái Nguyên chúng tôi đã phân lập đƣợc 24 khuẩn lạc nghi ngờ thuộc chi Lactobacillus. Theo khóa phân loại của Bergey’s (1984) mô tả vi khuẩn lactic có khuẩn lạc hình tròn đều, Gam dƣơng, có khả năng phân giải H2O2, không có khả năng di động..., dựa vào đặc điểm này, chúng tôi đã tuyển chọn đƣợc 14 khuẩn lạc mang đặc điểm của nhóm Lactobacillus trong số 24 khuẩn lạc
nghiên cứu.
3.1.1.2. Kết quả định lượng axít lactic sinh ra từ các chủng L. Bacillus phân lập được.
Từ 14 chủng vi khuẩn Lactobacillus thuần khiết phân lập đƣợc, chúng tôi tiến hành tuyển chọn các chủng có khả năng sinh axít lactic cao. Để xác định khả năng sinh axít, 14 chủng trên đƣợc nuôi lắc 200 vòng/phút ở 370
C theo phƣơng pháp Therner. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.2
Bảng 3.2.Khả năng sinh axít lactic của các chủng Lactobacillus phân lập được
Ký hiệu
chủng Chỉ tiêu theo dõi
Thời gian nuôi (giờ)
24 48 72 96
NC1
OD 0,42 1,80 2,17 1,54
pH* 6,12 5,01 4,27 4,26
Axít lactic sinh ra (%) 0,80 2,00 2,62 2,66
BB2
OD 0,85 2,01 1,95 1,70
pH* 5,10 4,01 3,99 3,98
Axít lactic sinh ra (%) 1,82 2,90 2,92 2,95
BC
OD 0,14 1,42 2,50 1,29
pH* 5,30 4,60 3,80 3,78
Axít lactic sinh ra (%) 1,55 2,40 3,30 3,35
NC2
OD 1,29 2,12 2,35 1,96
pH 5,78 5,02 4,10 3,80
Axít lactic sinh ra (%) 0,90 1,98 2,80 2,90
Formatted: Vietnamese
Formatted: Vietnamese
Formatted: Font: (Default) Times New Roman, Italic, Font color: Black, Vietnamese
Ký hiệu
chủng Chỉ tiêu theo dõi
Thời gian nuôi (giờ)
24 48 72 96
BB3
OD 0,37 1,89 1,92 1,75
pH* 5,82 5,62 5,05 5,00
Axít lactic sinh ra (%) 0,86 0,10 1,92 2,0
NS1
OD 0,42 2,03 2,50 2,20
pH* 5,50 4,50 3,70 3,69
Axít lactic sinh ra (%) 1,20 2,45 3,50 3,55
NS2
OD 0,48 1,92 1,98 1,72
pH* 6,07 5,50 5,02 5,00
Axít lactic sinh ra (%) 0,81 1,20 1,96 2,00
NS3
OD 0,42 2,12 2,23 2,05
pH* 5,81 5,45 4,80 4,70
Axít lactic sinh ra (%) 0,87 1,30 2,30 2,35
ND2
OD 0,35 1,05 1,45 1,25
pH* 6,15 5,92 5,77 5,70
Axít lactic sinh ra (%) 0,79 0,83 0,90 0,95
NQ1
OD 0,38 1,21 1,42 1,36
pH* 6,01 5,75 5,10 5,10
Axít lactic sinh ra (%) 0,82 0,90 1,81 1,82
NQ2
OD 0,45 2,01 2,17 2,00
pH* 5,79 5,42 4,85 4,80
Axít lactic sinh ra (%) 0,87 1,40 2,21 2,30
M2
OD 0,28 1,67 1,82 1,54
pH* 6,02 5,82 5,20 5,10
Axít lactic sinh ra (%) 0,81 0,86 1,70 1,82
CM3
OD 0,47 2,21 2,34 2,14
pH* 5,75 5,10 4,98 4,90
Axít lactic sinh ra (%) 0,92 1,82 2,05 2,15
TL4
OD 0,52 2,33 2,70 2,54
pH* 5,20 4,10 3,45 3,50
Axít lactic sinh ra (%) 1,40 2,85 3,70 3,72
(*)
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Qua kết quả bảng 3.2 chúng tôi thấy mật độ tế bào và axít lactic đƣợc sinh ra tăng theo chiều thuận, hầu hết các chủng đều sinh tổng hợp axít lactic mạnh trong khoảng thời gian 48-72 giờ, từ 72-96 giờ do pH của môi trƣờng giảm thấp (từ 5,77 – 3,45) ức chế sinh trƣởng của các chủng vi khuẩn lactic khảo sát, khi đó lƣợng axít lactic vẫn đƣợc tạo thành nhƣng với mức độ chậm. Chúng tôi đã tuyển chọn đƣợc chủng ký hiệu là TL4, có khả năng sinh axít lactic cao nhất là 3,72%sau 96 giờ nuôi cấy. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi tƣơng đồng với kết quả nghiên cứu của Mai Đàm Linh và cs (2008) [16] khi xác định đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn lactic phân lập trên địa bàn Hà Nội, tuy nhiên thấp hơn so với Hoque M.Z và cs (2010) [49] khi nghiên cứu về các đặc tính probiotic của các chủng Lactobacillus spp. đƣợc
phân lập ở các mẫu sữa chua của Bangladesh.
3.1.2. Kết quả khảo sát một số đặc tính probiotic của các chủng LactobacillusTL4 trong điều kiện in vitro LactobacillusTL4 trong điều kiện in vitro
Chủng vi khuẩn Lactobacillus TL4 đã tuyển chọn đƣợc nuôi trên môi trƣờng MRS dịch thể. Hình thái vi khuẩn, sắp xếp tế bào đƣợc xác định bằng phƣơng pháp nhuộm Gram cho thấy chủng Lactobacillus TL4 có dạng hình que ngắn, xếp thành từng đám. Chủng Lactobacillus TL4 thuộc nhóm Gram dƣơng, không có khả năng di động, hoạt tính catalaza âm tính và hô hấp tùy tiện.
* Kết quả khảo sát một số đặc tính probiotic của các chủng TL4 trong điều kiện in vitro
* Khả năng tồn tại ở môi trường pH axít thấp và pH kiềm
Khả năng chống chịu trong môi trƣờng axít và kiềm là một đặc tính quan trọng của các vi sinh vật probiotic, đối với các vi sinh vật probiotic muốn phát huy đƣợc tác dụng thì chúng phải sống sót đƣợc trong môi trƣờng đƣờng ruột của vật nuôi, nơi mà độ pH môi trƣờng thay đổi từ 3 ÷8. Theo Zavaglia và cs (2002) [69]cho rằng giá trị pH=2,0 và pH=3,0 ở điều kiện in vitro đƣợc xem là giới hạn quyết định trong sàng lọc các chủng vi sinh vật có tiềm năng sử dụng làm probiotic. Kết quả khảo sát khả năng sống sót ở môi trƣờng pH axít thấp và pH kiềm đƣợc trình bày ở bảng 3.3.
Formatted: Font color: Black, English (U.S.)
Formatted: Font color: Black, English (U.S.)
Formatted: Font: Bold, Font color: Black, English (U.S.)
Formatted: Font color: Black, English (U.S.)
Bảng 3.3. Khả năng chống chịu trong môi trường axít thấp và kiềm của các chủng LactobacillusTL4
ĐVT: (x106
CFU/ml)
Giá trị pH Ký hiệu chủng Thời gian (giờ)
0 1,5 3,0
2,0 TL4 7,81(0,06a 7,620,13ab 7,420,07b
3,0 TL4 7,180,03a 7,020,13ab 6,830,09c
8,0 TL4 7,030,08a 6,200,05b 6,080,07bc
a,b,c
Giá trị với chữ cái khác nhau là khác nhau đáng kể trong cùng một hàng (P <0,05).
Kết quả bảng 3.3 cho thấy: pH của môi trƣờng nuôi cấy có ảnh hƣởng lớn đến sự tồn tại và sinh trƣởng của các chủng khảo sát. Chủng Lactobacillus TL4 có xu hƣớng giảm số lƣợng tế bào sau 3 giờ thí nghiệm.
Với pH =2,0 thì hai chủng Lactobacillus TL4 có số lƣợng tế bào giảm không đáng kể sau 1,5 giờ thí nghiệm, tuy nghiên đến thời điểm 3 giờ thì mật độ tế bào xuống. Chủng LactobacillusTL4 là chủng ở khả năng sống xót cao, số lƣợng tế bào sống xót là 95,01%, (Hình 3.1). Ở pH=3,0 khả năng sống xót của chủng vi khuẩn cũng tƣơng tự nhƣ pH=2,0 (Hình 3.2).
7,2 7,3 7,4 7,5 7,6 7,7 7,8 7,9
0 1,5 3 Thời gian (giờ)
Hình 3.1. Biến động số lượng tế bào của các chủng Lactobacillus TL4 trong môi trường có pH=2,0
x106
CFU/ml
Formatted: Font: Bold, Font color: Black
Formatted: Font: (Default) Times New Roman, Italic, Font color: Black
Formatted: Font: Italic, Font color: Black
Formatted: Font: (Default) Times New Roman, Italic, Font color: Black
Formatted: Font: Italic, Font color: Black
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 6,6 6,7 6,8 6,9 7 7,1 7,2 7,3
0 1,5 3 Thời gian (giờ)
Hình 3.2. Biến động số lượng tế bào của các chủng Lactobacillus TL4 trong môi trường có pH=3,0
Với pH=8,0 giống nhƣ ở pH=2,0 và pH=3,0 chủng LactobacillusTL4 ở thời điểm 1,5 giờ số lƣợng tế bào đã giảm xuống, đến thời điểm 3 giờ thì gần nhƣ ít biến động (P<0,05) (Hình 3.3) 5,6 5,8 6 6,2 6,4 6,6 6,8 7 7,2
0 1,5 3 Thời gian (giờ)
Hình 3.3. Biến động số lượng tế bào của chủng Lactobacillus TL4 trong môi trường có pH=8
Theo Zavaglia và cs (2002) [75] axít hydrochloric (HCl) đƣợc tìm thấy trong dạ dày của vật nuôi là một chất ôxi hóa mạnh mẽ. Chính vì vậy, nó có
x106
CFU/ml
x106
CFU/ml
Formatted: Font: Bold, Font color: Black
Formatted: Font: (Default) Times New Roman, Italic, Font color: Black
Formatted: Font: Italic, Font color: Black
thể oxy hóa nhiều các hợp chất sinh học quan trọng nhƣ axít béo, protein, cholesterol và DNA trong các tế bào. Môi trƣờng pH thấp gây ức chế các hoạt động trao đổi chất và tăng trƣởng của các vi khuẩn lactic, dẫn tới phá hủy và giảm dần số lƣợng tế bào. Tuy nhiên, theo nghiên cứu của Boylston và cs (2004) [43] các chủng vi khuẩn lactic đáp ứng đƣợc đặc tính probiotic khi chúng có khả năng sống xót trong điều kiện in vitro (pH từ 2÷3 và pH=8) ở mật độ tế bào ≥106 CFU/ml sau 3 giờ thí nghiệm. Nhƣ vậy các chủng khảo sát trong thí nghiệm này là tiềm năng để sử dụng chế tạo probiotic cho vật nuôi. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu củacác tác giả Prasad J và cs (1998) [61]; Haddadin M.S.Y và cs (2004) [52]; khi nghiên cứu về khả năng tồn tại của vi khuẩn lactic trong điều kiện in vitro.
* Khả năng chống chịu của chủng Lactobacillus TL4 trong môi trường muối mật 0,3%
Khả năng chịu muối mật cũng là một đặc tính quan trọng của các vi sinh vật probiotic cho phép chúng tồn tại, phát triển và ảnh hƣởng lợi ích cho tiêu hóa của vật chủ, đã chỉ ra rằng probiotic chỉ phát huy tác dụng có lợi lên vật chủ khi chúng định cƣ và tồn tại trong ruột non. Môi trƣờng ruột non chứa pancreatine và muối mật là các yếu tố ức chế sinh trƣởng của vi sinh vật. Theo Prasad và cs (1998) [61] thức ăn đƣợc tiêu hóa trong ruột non của vật nuôi trong khoảng 4 giờ, khi tiêu hóa thức ăn nồng độ muối mật giới hạn trung bình là 0,3% (w/v). Kết quả khảo sát khả năng chống chịu trong môi trƣờng muối mật đƣợc trình bày ở bảng 3.4 và hình 3.4
Bảng 3.4. Khả năng chống chịu của chủng Lactobacillus TL4 trong môi trường có muối mật 0,3%
ĐVT: x105 CFU/ml
Ký hiệu chủng Thời gian (giờ)
0 1 2 3 4
LactobacillusTL4 6,500,08f 6,750,15d 7,050,09c 7,300,07b 7,650,06a
a,b,c,d,f
Giá trị với chữ cái khác nhau là khác nhau đáng kể trong cùng một hàng (P <0,05).
Formatted: Font: (Default) Times New Roman, Bold, Italic, Font color: Black
Formatted: Font: Bold, Italic, Font color: Black
Formatted: Font: Italic, Font color: Black
Formatted: Font: Bold, Font color: Black
Formatted: Font: (Default) Times New Roman, Italic, Font color: Black
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Từ kết quả bảng 3.4 ở nồng độ 0,3% muối mật đƣợc bổ sung, mật độ tế bào của chủng vi khuẩn ở thời điểm 4 giờ đều tăng so với thời điểm 0 giờ khảo sát. Chủng Lactobacillus TL4 không bị ảnh hƣởng của của muối mật tới sự tồn tại và sinh trƣởng của tế bào. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với kết quả nghiên cứu của tác giả Hoque M.Z và cs (2010) [54] khi tiến hành khảo sát đặc tính probiotic của các chủng Lactobacillus spp. trong môi trƣờng chứa muối mật với nồng độ 0,3%. 6,5 6,75 7,05 7,3 7,65 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 1 2 3 4
Thời gian (giờ)
Hình 3.4. Biến động số lượng tế bào của các chủng Lactobacillus TL4 trong môi trường có muối mật 0,3%
x105
CFU/ml
Formatted: Font color: Black, Not Expanded by / Condensed by , Kern at 14 pt
Formatted: Font: (Default) Times New Roman, Italic, Font color: Black, Not Expanded by / Condensed by
Formatted: Font: Italic, Font color: Black
Formatted: Font: Italic, Font color: Black, Not Expanded by / Condensed by , Kern at 14 pt
Formatted: Font color: Black, Not Expanded by / Condensed by , Kern at 14 pt
Formatted: Font color: Black, Kern at 14 pt
Formatted: Font color: Black, Not Expanded by / Condensed by , Kern at 14 pt
Formatted: Font color: Black, Kern at 14 pt
Formatted: Font: Italic, Font color: Black, Kern at 14 pt
Formatted: Font color: Black, Kern at 14 pt
Formatted: Centered
Formatted: Font: Bold, Font color: Black
* Khả năng ức chế vi sinh vật của các chủng Lactobacillus TL4
Một trong những đặc tính quan trọng làm căn cứ tuyển chọn các chủng vi khuẩn probiotic là khả năng ức chế các vi sinh vật gây bệnh. Trong hầu hết các nghiên cứu nhằm chọn lựa các vi sinh vật mang đặc tính probiotic dùng trong phòng và điều trị bệnh ở gia súc và gia cầm các nhà khoa học đều quan tâm và chú trọng đến đặc tính này với mục tiêu khi đƣa vào trong đƣờng tiêu hóa ngoài khả năng tăng chuyển hóa thức ăn, tăng khả năng miễn dịch cho vật chủ,... thì còn có tác dụng ức chế sự phát triển của các vi sinh vật có hại, hạn chế các bệnh đƣờng tiêu hóa. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.5.
Bảng 3.5. Khả năng ức chế các chủng vi khuẩn kiểm định của chủng Lactobacillus TL4 Ký hiệu chủng Đƣờng kính vòng ức chế (∆D = D – d, mm) P.aeruginosa VTCC-B-481 ((105 CFU/ml) B. subtilis VTCC-B-888 ((105 CFU/ml) E. coli VTCC-B-883 ((105 CFU/ml) S. aureus ATCC 25923 ((105 CFU/ml) TL4 ((109 CFU/ml) 16,5(0,2a,1 16,0(0,3ab,1 12,5(0,5c,1 12,5(0,5cd,1 a,b,c
Giá trị với chữ cái khác nhau là khác nhau đáng kể trong cùng một hàng (P <0,05).
1,2,3,4
Giá trị với chữ số khác nhau là khác nhau đáng kể trong cùng một cột (P <0,05).
Kết quả bảng 3.5 trên cho thấy sau 24 giờ nuôi trong tủ ấm 370
C chủngLactobacillus TL4 có hoạt tính ức chế cả vi khuẩn Gram âm và Gram dƣơng. Chủng LactobacillusTL4 ức chế mạnh với 4 chủng vi khuẩn kiểm định (đƣờng kính vòng vô khuẩn ≥12mm).
Formatted: Font: (Default) Times New Roman, 14 pt, Bold, Italic, Font color: Black
Formatted: 5f, Line spacing: single, Widow/Orphan control, Adjust space between Latin and Asian text, Adjust space between Asian text and numbers
Formatted: Line spacing: Multiple 1.4 li, Widow/Orphan control, Adjust space between Asian text and numbers
Formatted: Font: Bold
Formatted: Space Before: 3 pt, Adjust space between Latin and Asian text, Adjust space between Asian text and numbers
Formatted: Space Before: 3 pt, Adjust space between Latin and Asian text, Adjust space between Asian text and numbers
Formatted: Space Before: 3 pt
Formatted: Space Before: 3 pt
Formatted: Space Before: 6 pt, After: 6 pt, Line spacing: single
Formatted: Space Before: 4 pt, Line spacing: Multiple 1.55 li
Formatted: Font: (Default) Times New Roman, Italic, Font color: Black
Formatted: Font: Italic, Font color: Black, Condensed by 0.2 pt, Kern at 14 pt
Formatted: Font color: Black, Condensed by 0.2 pt, Kern at 14 pt
Formatted: Font: (Default) Times New Roman, Italic, Font color: Black
Formatted: Font: Italic, Font color: Black, Condensed by 0.2 pt, Kern at 14 pt
Formatted: Font color: Black, Condensed by 0.2 pt, Kern at 14 pt
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
3.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU, CHẾ TẠO VÀ KIỂM NGHIỆM CHẾ PHẨM LACTOVET PHẨM LACTOVET
3.2.1 Kết quả lên men Lactobacillus TL4 trên thiết bị lên men Infors và tạo chế phẩm. chế phẩm.
Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng của chủng L.
plantarum TL4: Nhu cầu oxy, nồng độ glucose, pH, nhiệt độ, nồng độ NaCl
đƣợc tổng hợp ở bảng 3.6.
Bảng 3.6. Bảng tổng hợp các điều kiện tối ƣu cho sinh trƣởng
của chủng
L. plantarum TL4 khi lên men sục khí
Yếu tố khảo sát Điều kiện tối ƣu Các thông số cài đặt khi lên men
Nhiệt độ (o
C) 32oC Kiểm soát lên men ở 32o
C
pH môi trƣờng pH = 6 Kiểm soát dịch lên men ở pH = 6
Nồng độ glucose 2% Môi trƣờng MRS có bổ sung glucose 2%
Nồng độ NaCl 3% Môi trƣờng MRS có bổ sung NaCl 3%
Nhu cầu oxy oxy thấp Nhu cầu Tốc độ khuấy 300 v/p; sục khí 0,3vvm Kết quả động học lên men của chủng Lacbacillus plantarum TL4 đƣợc