2.3.1. Phương pháp nghiên cứu xác định một số đặc tính sinh học in vitro của chủng vi khuẩn phân lập được dùng để chế tạo chế phẩm
2.3.1.1. Một số đặc tính hình thái, nuôi cấy và sinh vật hóa học
*Phương pháp thu thập mẫu
Các mẫu lên men đƣợc thu thập với khối lƣợng khoảng 200g/mẫu cho vào túi nilon vô trùng (với mẫu rắn); 100ml/mẫu (đối với mẫu lỏng). Mẫu thu thập cần ghi đủ các thông tin: tên mẫu, kí hiệu, ngày lấy, địa điểm, ngƣời lấy và đặc điểm của mẫu (màu, mùi,...). Các mẫu trên sau khi thu thập tiến hành phân lập ngay hoặc bảo quản ở 40C (không quá 24 giờ) (Nguyễn Lân Dũng và cs 1972) [6].
* Phương pháp hoạt hóa mẫu
Pha môi trƣờng MRS lỏng sau đó phân phối vào các bình tam giác vô trùng chứa 90ml môi trƣờng, khử trùng ở 1210C trong 15 phút. Cân 10g (đối với mẫu ở dạng rắn) hoặc 10ml (đối với mẫu ở dạng lỏng) mẫu cho vào bình môi trƣờng trong tủ cấy vô trùng, nuôi lắc ở 370C, 100 vòng/phút trong 24 giờ (Nguyễn Lân Dũng và cs 1972) [6].
* Phương pháp nuôi cấy, phân lập
Tiến hành pha loãng mẫu bằng cách hút 100µl dịch hoạt hóa vào ống eppendoff chứa 900µl nƣớc cất vô trùng lắc đều khoảng 30 giây đƣợc nồng độ pha loãng 10-1, tiếp tục tiến hành pha loãng mẫu cho đến nồng độ pha loãng thích hợp. Hút 100µl ở 3 nồng độ pha loãng liên tiếp trang đĩa, mỗi
Formatted: Font color: Black, English (U.S.)
Formatted: Font: 14 pt, Font color: Black
Formatted: Font color: Black, English (U.S.)
Formatted: Font color: Black, English (U.S.)
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
nồng độ pha loãng trang ở 3 đĩa petri môi trƣờng MRS. Bao gói các đĩa sau khi đã trang nuôi ở 370C, 48 giờ.
Kiểm tra sự xuất hiện các khuẩn lạc trên đĩa petri, tách và thuần khiết các khuẩn lạc có vòng trong suốt xung quanh (axít phân giải CaCO3 tạo vòng trong). Nhận dạng các khuẩn lạc này bằng đặc điểm hình thái tế bào, nhuộm Gram, thử phản ứng catalase. Các vi khuẩn thuộc nhóm Lactobacillus thì cấy chuyển sang đĩa petri mới bằng phƣơng pháp cấy ria để thuần giống. Khi đã thuần ta tiến hành giữ giống trong ống nghiệm môi trƣờng MRS thạch nghiêng hoặc trong môi trƣờng MRS lỏng có bổ sung 40% glyxerol và bảo quản ở 800
C (Yavuzdurmaz, 2007) [68].
*Phương pháp thử nghiệm catalaza
Thuốc thử: dung dịch 3% H2O2 (hydrogen peroxide)
Nguyên tắc: Các vi sinh vật hiếu khí và kị khí tùy ý chứa chuỗi truyền điện tử có xytochrome đều có enzyme catalase (trừ Streptococcus spp.).
Catalase thủy phân H2O2 thành H2O và O2 (đƣợc ghi nhận qua hiện tƣợng sủi bọt khí).
Tiến hành: Dung dịch H2O2 3% cần đƣợc giữ lạnh trong chai màu nâu, tránh ánh sáng, dung dịch đệm photphate pH 7,0. Nhỏ một giọt H2O2 3% lên sinh khối vi sinh vật trên đĩa môi trƣờng nuôi cấy chủng vi sinh vật thuần cần kiểm tra. Ghi nhận sự sủi bọt nếu có.
Kết quả: Thử nghiệm là (+) khi có hiện tƣợng sủi bọt khí do O2 đƣợc tạo ra, ngƣợc lại là (-) khi không có sự sủi bọt khí. Vi khuẩn Lactobacilllus spp.cho phản ứng catalase âm tính (Yavuzdurmaz, 2007) [74].
* Phương pháp nhuộm Gram
Nguyên tắc: Nhuộm Gram có vai trò đặc biệt quan trọng trong việc phân loại vi khuẩn. Trong quá trình nhuộm Gram, tế bào bƣớc đầu đƣợc xử lý với tím kết tinh và iot nên có sự tạo thành phức chất tím kết tinh iốt bên trong tế bào. Khi vi khuẩn Gram âm bị tẩy cồn, lipit của lớp màng ngoài bị hòa tan làm tăng tính thấm của màng dẫn đến sự rửa trôi phức chất tím-iốt và làm cho vi khuẩn mất màu. Khi nhuộm bổ sung chúng sẽ bắt màu với thuốc (đỏ vàng với
Safranin hay đỏ tía với Fuchsin). Ở vi khuẩn Gram dƣơng, cồn làm cho các lỗ trong peptidoglycan co lại do đó phức chất tím - iốt bị giữ lại bên trong tế bào.
Tiến hành: Lấy một giọt nƣớc cất vô trùng nhỏ lên lam kính. Dùng que cấy vòng lấy mẫu. Hòa mẫu vào giọt nƣớc và dàn đều trên lam kính có đƣờng kính khoảng 1-2cm. Cố định tiêu bản trên ngọn lửa đèn cồn. Nhuộm bằng dung dịch tím kết tinh (crystal violet) trong khoảng 1 phút, rửa bằng nƣớc. Nhuộm tiếp bằng dung dịch lugol trong 1 phút, rửa lại bằng nƣớc. Tẩy màu bằng dung dịch etanol (etanol 95% - axeton 1:1) trong 30 giây. Sau đó nhuộm tiếp bằng safranin trong 30 giây, rửa qua nƣớc, thấm khô. Nhỏ dầu lên tiêu bản và quan sát dƣới kính hiển vi điện tử ở vật kính dầu 100X.
Kết quả: Khi soi dƣới kính hiển vi điện tử vi khuẩn Gram dƣơng có màu tím, vi khuẩn Gram âm có màu hồng (Nguyễn Lân Dũng và cs 1972) [6].
* Phương pháp thử khả năng di động
Nguyên tắc: Vi sinh vật di động nhờ cấu trúc protein gọi là tiên mao (flagella) có ở nhiều vi khuẩn thuộc giống trực khuẩn và cầu trực khuẩn. Khả năng di động là một trong những căn cứ để phân biệt vi sinh vật. Khả năng này có thể đƣợc quan sát dựa vào sự tăng trƣởng và di động của vi sinh vật bên trong môi trƣờng thạch mềm.
Tiến hành: Sử dụng môi trƣờng bán lỏng (MRS có bổ sung agar 8g/l). Môi trƣờng đƣợc đun tan, phân phối thành dung tích 5ml vào các ống nghiệm vô trùng, hấp khử trùng ở 1210C trong vòng 15 phút. Các ống môi trƣờng này đƣợc làm nguội ở trạng thái đứng và bảo quản ở 4-100C. Dùng que cấy thẳng thu lấy sinh khối từ khuẩn lạc của chủng thuần. Chủng đƣợc cấy bằng cách đâm sâu đầu que cấy xuyên vào giữa môi trƣờng trong ống nghiệm đến độ sâu khoảng 2/3 môi trƣờng. Các ống môi trƣờng đƣợc ủ ở 370
C trong 24-48h. Kết quả: Thử nghiệm là (+) vi khuẩn có khả năng di động khi vi sinh vật mọc lan ra khỏi đƣờng cấy và làm đục môi trƣờng xung quanh; là (-) vi khuẩn không có khả năng di động khi vi sinh vật chỉ mọc dọc theo đƣờng cấy trong khi môi trƣờng xung quanh vẫn trong (Nguyễn Lân Dũng và cs 1972) [6].
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
* Phương pháp định lượng vi khuẩn lactic
Chọn các nồng độ pha loãng mà số lƣợng khuẩn lạc mọc trên môi trƣờng thạch không quá 150 khuẩn lạc. Tiến hành đếm số lƣợng khuẩn lạc ở 2 nồng độ pha loãng liên tiếp. Từ đó tính toán giá trị khuẩn lạc trung bình.
Tính kết quả:
Để xác định tổng số vi khuẩn lactic có trong 1g (1ml) mẫu kiểm nghiệm, chọn những đĩa có không quá 150 khuẩn lạc của 2 đậm độ pha loãng liên tiếp. Sự phân bố các khuẩn lạc phải hợp lý: Độ pha loãng càng cao thì số khuẩn lạc càng ít. Tổng số vi khuẩn Lactic có trong 1g hoặc 1ml mẫu thử (N) đƣợc tính theo công thức sau:
( C
N = ---
Vx( n1+ 0,1xn2 )d Trong đó:
C : Tổng số khuẩn lạc đếm đƣợc trên tất cảcác đĩa đã chọn. V : Thể tích cấy trên mỗi đĩa tính bằng ml
n1 : Số đĩa của đậm độ pha loãng thứ nhất đƣợc giữ lại n2 : Số đĩa của đậm độ pha loãng thứ hai đƣợc giữ lại
d : Hệ số pha loãng của đậm độ pha loãng thứ nhất
*Phương pháp định lượng axít lactic được sinh ra (TCVN 5860–1994)
Tiến hành: Lấy 10ml dịch lên men ly tâm ở 8000 vòng/phút trong 7 phút
loại bỏ sinh khối tế bào, bổ sung 20ml nƣớc cất và thêm 2 giọt phenolphthalein. Sau đó chuẩn độ bằng NaOH 0,1N đến khi xuất hiện màu hồng nhạt bền trong 30 giây. Xác định thể tích NaOH 0,1N (ml) đã sử dụng cho chuẩn độ. Độ axít đƣợc tính bằng công thức sau:
% axít lactic = VNaOH x 0,009 (g/l)
(1 ml dung dịch NaOH tƣơng đƣơng 0,009g axít lactic)
2.3.1.2. Phương pháp xác định một số đặc tính probiotic củachủng vi khuẩn phân lập được trong điều kiện in vitro
* Phương pháp đánh giá khả năng tồn tại trong môi trường pH axít thấp và pH kiềm
Pha chế đệm PBS dạng lỏng và phân phối đồng đều ra 5 bình tam giác có dung tích 100ml, điều chỉnh pH dung dịch đệm ở ngƣỡng 2; 3 và 8 bằng dung dịch HCl 30% và NaOH 1M. Tiến hành khử trùng ở 1210C trong 15 phút.
Các chủng vi khuẩn lactic đƣợc nuôi lắc 250vòng/phút ở 370C trong 24h. Thu dịch nuôi ly tâm thu cặn tế bào ở 9000vòng/phút trong 7 phút, rửa 2 lần bằng đệm PBS 7,2; bổ sung 200µl vào các bình tam giác có chứa đệm PBS có pH lần lƣợt là 2; 3 và 8 lắc đều trong vòng 3 phút. Thu dịch tiến hành đo OD600nm và định lƣợng số lƣợng tế bào vi khuẩn lactic ở các thời điểm T0, T1,5, T3 tƣơng ứng với các thời điểm 0h; 1,5h và 3h (Sahadeva R.P.K và cs 2011) [58].
* Phương pháp đánh giá khả năng chống chịu trong muối mật
Bổ sung vào 100ml môi trƣờng MRS với các nồng độ muối mật 0,3%, khử trùng ở 121o
C trong 15 phút. Hút 1000µl dịch nuôi các chủng vi khuẩn lactic đƣợc hoạt hóa 24h vào các bình thí nghiệm ở các nồng độ muối mật khác nhau. Đếm mật độ tế bào ở các thời điểmT0, T1, T2, T3, T4 thí nghiệm (Hoque M.Z và cs 2010) [54].
* Phương pháp xác định khả năng ức chế chủng vi khuẩn kiểm định
Hoạt tính kháng khuẩn của chủng Lactobacillus đƣợc xác định bằng
phƣơng pháp đục lỗ thạch nhƣ sau: cấy trải chủng vi khuẩn kiểm định trên môi trƣờng MPA dạng thạch, sau đó tiến hành đục lỗ thạch. Nhỏ 100μl dịch nuôi cấy đã loại bỏ cặn tế bào của chủng vi khuẩn lactic (dịch nuôi cấy đã đƣợc trung hòa về pH=7 bằng NaOH 0,1N) vào lỗ đã đục, để ở 40
C trong 6h, sau đó chuyển các đĩa thạch này sang 370C trong 24h. Sau 24h, tiến hành đo vòng kháng khuẩn đƣợc hình thành (Nguyễn Lân Dũng và cs 1972 [6]). Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng vi sinh vật tuyển chọn đƣợc tính bằng đƣờng kính vòng vô khuẩn ∆D:
∆D = D – d (mm) Trong đó:
∆D: Đƣờng kính thực của vòng vô khuẩn (mm)
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
d: Đƣờng kính lỗ thạch (10 mm).
2.3.2. Phương pháp chế tạo chế phẩm và kiểm tra chất lượng của chế phẩm
2.3.2.1. Chế tạo chế phẩm
Lactovet là chế phẩm đƣợc chế tạo từ chủng Lactobacillus plantarum TL4 và các chất phụ gia
Bảng 2.2: Tiêu chuẩn cơ sở của sản phẩm Lactovet trong 1kg thành phẩm
TT Chỉ tiêu ĐV tính Mức chất lƣợng
1 Độ ẩm (max) % 10
2 Lactobacillus plantarum TL4 CFU/g 1011
3 Chất mang tá dƣợc Vừa đủ 0,5 kg
Không có kháng sinh và hóa chất độc hại Quy trình chế tạo chế phẩm Lactovet:
Từ chủng Lactobacillus plantarum TL4 (trình tự gen mã hóa ARNr 16S của chủng L. TL4 đƣợc đăng ký tại ngân hàng gen thế giới với mã số truy là
JQ937330) có khả năng sinh acid lactic cao đƣợc phân lập, tuyển chọn tại khu vực thành phố Thái Nguyên. Chúng tôi tiến hành tối ƣu hóa và nhân sinh khối tế bào trên thiết bị lên men sục khí Infors của Thụy Sỹ. Từ sinh khối tế bào thu đƣợc tiến hành bổ sung thêm các chất phụ gia tạo chế phẩm sinh học (probiotic) có tên thƣơng mại là chế phẩm Lactovet.
* Thông tin tóm tắt về sản phẩm:
Thành phần: Lactobacillus plantarum TL4 và các chất phụ gia
Độ ẩm 10%
Số lƣợng tế bào/gam chế phẩm: ~ 1011
CFU/g Đối tƣợng sử dụng: dùng trong chăn nuôi
* Công dụng:
Chế phẩm Lactovet làm tăng cƣờng hệ vi sinh vật có lợi trong đƣờng tiêu hóa, kích thích tăng trọng, giảm tiêu tốn thức ăn, khống chế hiệu quả mùi hôi, giảm ô nhiễm môi trƣờng, khống chế bệnh tiêu chảy ở gia súc gia cầm.
Formatted: Font color: Black, English (U.S.)
Sơ đồ quy trình chế tạo chế phẩm Lactovet MẪU ĐẶC TRƢNG PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG LACTOBACILLUS SPP - Nồng độ NaCl - Ảnh hƣởng tốc độ khuấy - Nồng độ glucose bổ sung
- Nhu cầu oxy
- Ảnh hƣởng của pH
- Ảnh hƣởng nhiệt độ
- Đánh giá chế phẩm - Thời gian bảo quản - Tăng trƣởng của vật nuôi - Đánh giá chế phẩm - Bệnh đƣờng tiêu hóa - Nồngđộ khí thải (NH3, H2S,…)
- Sinh axit lactic cao
- Chống chịu trong môi trƣờng pH kiềm, axit môi - Sinh bacteriocin - Chống chịu trong muối mật - Khả năng đối kháng -Đăngký http://www.ncbi.nlm.ni h.gov (mã số: JQ937330) Chế phẩm sinh học Lactovet
Formatted: Font color: Black, Portuguese (Brazil)
Formatted: Font color: Black, Portuguese (Brazil)
Formatted: Font color: Black, Portuguese (Brazil)
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Trong đó:
M : Là mẫu
N: Tổng số sản phẩm trong lô
* Phương pháp xác định các chỉ tiêu chất lượng của chế phẩm Lactovet
Các đặc tính sinh học, lý học và hóa học của chế phẩm Lactovet đƣợc kiểm tra theo quy trình kiểm tra thƣờng quy của IVAC về các đặc điểm sau:
- Các đặc điểm về màu sắc, mùi vị, độ kín của bào gói, độ hòa tan trong nƣớc đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp cảm quan.
- Độ ẩm đƣợc xác định bằng phƣơng pháp máy phân tích độ ẩm (Moisture Analyzer-MX50) và đọc kết quả theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất.
- Độ pH đƣợc xác định bằng cách: hoàn nguyên chế phẩm Lactovet trong nƣớc cất theo tỉ lệ 1:10 (5g chế phẩm Lactovet + nƣớc cất vô trùng vừa đủ 50 ml). Xác định độ pH bằng máy đo pH (Hanna Instruments, Model ACN003 417 990) và đọc kết quả theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất.
- Kiểm tra độ thuần khiết:
Chế phẩm Lactovet đƣợc pha loãng thành các nồng độ từ 10-1
đến 10-8. Láng 0,5 ml canh trùng nồng độ pha loãng lên các môi trƣờng thạch máu, thạch MRS. Mỗi nồng độ 2 đĩa thạch. Nuôi cấy ở tủ ấm 370C trong 48 giờ. Đồng thời, lấy 0,5 ml canh trùng có nồng độ 10-3
, 10-4, mỗi nồng độ cho vào 2 đĩa thạch Sabouraud, láng đều và nuôi cấy ở 22-280C, theo dõi 7 ngày đọc kết quả để đánh giá mức độ nhiễm nấm.
Sản phẩm đạt yêu cầu khi không bị tạp phẩm và không có nấm mọc ở tất cả các đĩa thạch.
- Kiểm tra độ an toàn của chế phẩm Lactovet trên chuột bạch:
Hòa tan chế phẩm Lactovet trong nƣớc cất theo tỷ lệ 1:10 (5 g chế phẩm Lactovet + nƣớc cất vừa đủ 50 ml). Tiêm vào phúc xoang cho 5 chuột bạch liều 0,2 ml/con và 5 chuột bạch liều 0,5 ml/con. Lô chuột đối chứng: chuột đƣợc tiêm nƣớc cất với liều 0,2 ml/con. Theo dõi chuột trong vòng 7 ngày.
Sản phẩm đạt yêu cầu khi chuột ở lô thí nghiệm và lô đối chứng đều sống khỏe mạnh, không sốt hoặc có biểu hiện bất thƣờng qua thời gian theo dõi.
- Xác định khả năng sống trong điều kiện nhiệt độ và thời gian bảo quan khác nhau:
Hòa tan chế phẩm Lactovet trong nƣớc cất theo tỷ lệ 1:10 (5 g chế phẩm Lactovet + nƣớc cất vừa đủ 50 ml), pha loãng theo cơ số 10 để đƣợc các nồng độ từ 10-2
đến 10-8. Nhỏ 0,1 ml dung dịch pha loãng ở nồng độ10-6
, 10-7, 10-8 vào các đĩa thạch MRS. Mỗi nồng độ 2 đĩa thạch. Nuôi cấy ở nhiệt độ 370
C trong 48 giờ. Tiến hành đếm số lƣợng khuẩn lạc của vi khuẩn trên đĩa thạch, rồi tính trung bình cho mỗi nồng độ.
Số lƣợng vi khuẩn trong 1 g chế phẩm đƣợc tính theo công thức: X = 10 x a x b
Trong đó:
X là tổng lƣợng vi khuẩn có trong 1 g mẫu ban đầu.
a là số lƣợng vi khuẩn trung bình của nồng độ pha loãng thích hợp đƣợc chọn. b là hệ số pha loãng.
Hệ số 10: vì cấy 0,1 ml.
Sản phẩm đạt yêu cầu khi độ sống của từng chủng vi khuẩn phải ≈1011
CFU/g sản phẩm.
2.3.3. Phương pháp thử nghiệm chế phẩm Lactovet trong phòng hội chứng tiêu chảy ở lợn con.
Chúng tôi tiến hành bố trí thí nghiệm có bổ sung chế phẩm Lactovet vào thức ăn cho đàn lợn sử dụng. Sau đó, theo dõi các chỉ tiêu về sinh trƣởng, chỉ tiêu về thức ăn và sự biến động về số lƣợng Salmonella spp. và E.coli trong
đƣờng ruột của lợn thí nghiệm.
2.3.3.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm
* Bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm đƣợc bố trí theo phƣơng pháp phân lô so sánh với số lƣợng
Formatted: Font color: Black, French (France)
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
lợn thí nghiệm là 30 con đƣợc chia làm 2 lô nhƣ sau: + Lô thí nghiệm 15 con đƣợc nuôi ở 1 ô chuồng. + Lô đối chứng 15 con đƣợc nuôi ở 1 ô chuồng.
Lợn ở 2 lô thí nghiệm và đối chứng phải đảm bảo đồng đều về khối