Tiêu chảy ở lợn đƣợc coi nhƣ là một hội chứng nên việc điều trị tiêu chảy ở lợn là kết hợp của nhiều biện pháp. Một nguyên tắc chung là can thiệp sớm, loại trừ căn nguyên gây bệnh, bổ sung nƣớc và chất điện giải, khống chế, khắc phục rối loạn tiêu hoá, hấp thu... giúp quá trình tiêu hoá trở lại trạng thái sinh lý bình thƣờng.
1.4.2.1. Điều trị nguyên nhân gây bệnh
Nguyên nhân chủ yếu trong hội chứng tiêu chảy của lợn là do một số vi khuẩn gây bệnh đƣờng ruột, bao gồm vi khuẩn hiếu khí, yếm khí tuỳ tiện hoặc yếm khí bắt buộc. Những vi khuẩn thƣờng gặp là E. coli, Salmonella spp., Cl.
perfringens, Shigella spp., Klebsiella spp., Streptococcus ... Dùng thuốc kháng sinh có tác dụng cao với các vi khuẩn nhƣ E. coli và Salmonella spp.
gây ra hội chứng tiêu chảy ở lợn con. Tuy nhiên, tình trạng kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn gây bệnh ở vật nuôi ngày càng gia tăng. Vì vậy, việc kiểm tra tính mẫn cảm của vi khuẩn gây bệnh với kháng sinh để lựa chọn loại kháng sinh thích hợp là yêu cầu cần thiết nhằm nâng cao hiệu quả điều trị bệnh (Radostits và cs, 1994) [62].
1.4.2.2. Điều trị triệu chứng tiêu chảy
Formatted: Font color: Black, Swedish (Sweden)
Formatted: Swedish (Sweden)
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Lợn bị tiêu chảy do E. coli khi điều trị, ngoài việc dùng kháng sinh sớm từ đầu nên dùng kết hợp một số thuốc hay hóa dƣợc có tác dụng ức chế sự sản sinh và ảnh hƣởng của độc tố đƣờng ruột Enterotoxin do vi khuẩn phóng thích ra. Kết hợp sử dụng dung dịch các chất điện giải nhƣ dung dịch đƣờng glucose, muối natri, kali... cung cấp, bổ sung lƣợng nƣớc và các chất điện giải bị mất trong khi tiêu chảy. Trong điều trị cần thực hiện tốt chế độ ăn uống, chống nhiễm khuẩn và điều trị hiện tƣợng mất nƣớc, chất điện giải. Trong đó, bổ sung nƣớc và chất điện giải có vai trò quan trọng vì có tới 80% bệnh súc chết do bệnh lý này (Nguyễn Văn Tâm, Cù Hữu Phú (2006) [32].
Chƣơng 2
NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.1.1. Khảo sát một số đặc tính sinh vật học in vitro của chủng vi khuẩn Lactobacillus phân lập được dùng chế tạo chế phẩm. Lactobacillus phân lập được dùng chế tạo chế phẩm.
2.1.2. Nghiên cứu chế tạo và kiểm nghiệm chế phẩm Lactovet.
2.1.3. Thử nghiệm chế phẩm trong phòng hội chứng tiêu chảy ở lợn con. 2.1.4. Thử nghiệm một số phác đồ điều trị hội chứng tiêu chảy ở lợn con. 2.1.4. Thử nghiệm một số phác đồ điều trị hội chứng tiêu chảy ở lợn con.
2.2. NGUYÊN LIỆU DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU
2.2.1. Đối tượng nghiên cứu
- Chủng vi khuẩn Lactobacillus phân lập đƣợc.
- Lợn con sau cai sữa nuôi tại huyện Vĩnh Tƣờng – tỉnh Vĩnh Phúc. - Chế phẩm sinh học Lactovet.
2.2.2. Nguyên vật liệu và dụng cụ, trang thiết bị
2.2.2.1. Nguyên vật liệu
* Mẫu nghiên cứu
- Các sản phẩm lên men đƣợc thu thập ở khu vực thành phố Thái Nguyên. - Mẫu phân: lấy khoảng 3-5 gam, đựng trong ống nghiệm vô trùng, có nút vặn để tránh sự nhiễm tạp kế phát.
Các mẫu đƣợc ghi rõ số liệu, bảo quản nghiêm ngặt trong điều kiện lạnh ở 4o
C, theo Quy trình nghiên cứu vi sinh vật của Viện Thú y Quốc gia.
* Động vật thí nghiệm
- Chuột trắng khỏe mạnh (trọng lƣợng 18 – 20 g/con)
- Lợn con sau cai sữa (21- 84 ngày tuổi) nuôi ở huyện Vĩnh Tƣờng – tỉnh Vĩnh Phúc.
2.2.2.2. Các loại môi trường, hóa chất và dụng cụ, thiết bị
- Các môi trƣờng kiểm tra gồm: nƣớc thịt ống, nƣớc thịt lọ 50ml, thạch máu, thạch thƣờng, thạch nấm, yếm khí.
Formatted: Font color: Black, Swedish (Sweden)
Formatted: Font color: Black, Swedish (Sweden)
Formatted: Font: 14 pt, Font color: Black, Swedish (Sweden)
Formatted: Font color: Black, Swedish (Sweden)
Formatted: Font color: Black, Swedish (Sweden)
Formatted: Font color: Black
Formatted: Font color: Black, Vietnamese
Formatted: Font color: Black, Vietnamese
Formatted: Font color: Black, Vietnamese
Formatted: Font color: Black, Vietnamese
Formatted: Font: 14 pt, Font color: Black
Formatted: Font color: Black, Swedish (Sweden)
Formatted: Font color: Black, Swedish (Sweden)
Formatted: Font color: Black, Swedish (Sweden)
Formatted: Swedish (Sweden)
Formatted: Swedish (Sweden)
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
+ Các loại môi trƣờng dùng nuôi cấy và phân lập vi khuẩn nhƣ XLD agar (Xylose Lysine Deoxycholate Agar), MacConkey agar, thạch máu, thạch thƣờng, thạch Endo, EMB (Eosin-metyl- Blue)... và các môi trƣờng đƣờng, Kligler, VP (Voges Proskauer), MR (Metyl Red)...
+ Môi trƣờng pepton water Muller Kauffmann và Rappaport Vassiliadis enrichment Broth.
- Các loại hóa chất bao gồm:
+ Thuốc nhuộm Gram, dung dịch Kovac’s, dung dịch chỉ thị Andrade + Muối mật Oxgall (do hãng Sigma cung cấp)
+ Giấy tẩm kháng sinh các loại do hãng Oxoid của Anh, Biorad ... và các loại hóa chất khác dùng trong nghiên cứu đƣợc thể hiện ở bảng 2.1.
Bảng 2.1. Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
Tên hóa chất Xuất xứ Tên hóa chất Xuất xứ
Pepton Tây Ban Nha KH2PO4 Mỹ
Cao thịt Tây Ban Nha CH3COONa Trung Quốc
Cao nấm men Pháp MgSO4.7H2O Trung Quốc
Glucose Trung Quốc MnSO4.H2O Trung Quốc
Agar Việt Nam NaCl Trung Quốc
Phenol Tây Ban Nha HCl Trung Quốc
Triammonium
citrate Trung Quốc NaOH Trung Quốc
Tween 80 Trung quốc Muối mật Mỹ
Tím kết tinh Trung quốc Dung dịch etanol Trung quốc
Lugon Trung quốc Dầu vaselin Mỹ
Safranin Trung quốc Cồn 900 Việt Nam
SDS Mỹ Tris-HCl Mỹ dNTPs Mỹ Ethidium Bromide (EtBr) Đức EDTA Mỹ Glycerol Đức Phenol Đức Ethanol Đức Methanol Đức Chloroform Đức Isoamylalcohol Đức Agar Đức
Thang ADN chuẩn Fermentas, Invitrogen Bộ kit tinh sạch
- Thiết bị sử dụng: Sử dụng trang thiết bị sẵn có tại Viện Khoa học sự sống – Đại học Thái Nguyên và phòng nghiên cứu Bộ môn Vi trùng - Viện Thú y Quốc gia.
2.2.3. Địa điểm nghiên cứu
- Huyện Vĩnh Tƣờng - tỉnh Vĩnh Phúc và tại phòng nghiên cứu của Viện Khoa học sự sống – Đại học Thái Nguyên và tại Bộ môn Vi trùng Viện Thú y Quốc gia.
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phương pháp nghiên cứu xác định một số đặc tính sinh học in vitro của chủng vi khuẩn phân lập được dùng để chế tạo chế phẩm
2.3.1.1. Một số đặc tính hình thái, nuôi cấy và sinh vật hóa học
*Phương pháp thu thập mẫu
Các mẫu lên men đƣợc thu thập với khối lƣợng khoảng 200g/mẫu cho vào túi nilon vô trùng (với mẫu rắn); 100ml/mẫu (đối với mẫu lỏng). Mẫu thu thập cần ghi đủ các thông tin: tên mẫu, kí hiệu, ngày lấy, địa điểm, ngƣời lấy và đặc điểm của mẫu (màu, mùi,...). Các mẫu trên sau khi thu thập tiến hành phân lập ngay hoặc bảo quản ở 40C (không quá 24 giờ) (Nguyễn Lân Dũng và cs 1972) [6].
* Phương pháp hoạt hóa mẫu
Pha môi trƣờng MRS lỏng sau đó phân phối vào các bình tam giác vô trùng chứa 90ml môi trƣờng, khử trùng ở 1210C trong 15 phút. Cân 10g (đối với mẫu ở dạng rắn) hoặc 10ml (đối với mẫu ở dạng lỏng) mẫu cho vào bình môi trƣờng trong tủ cấy vô trùng, nuôi lắc ở 370C, 100 vòng/phút trong 24 giờ (Nguyễn Lân Dũng và cs 1972) [6].
* Phương pháp nuôi cấy, phân lập
Tiến hành pha loãng mẫu bằng cách hút 100µl dịch hoạt hóa vào ống eppendoff chứa 900µl nƣớc cất vô trùng lắc đều khoảng 30 giây đƣợc nồng độ pha loãng 10-1, tiếp tục tiến hành pha loãng mẫu cho đến nồng độ pha loãng thích hợp. Hút 100µl ở 3 nồng độ pha loãng liên tiếp trang đĩa, mỗi
Formatted: Font color: Black, English (U.S.)
Formatted: Font: 14 pt, Font color: Black
Formatted: Font color: Black, English (U.S.)
Formatted: Font color: Black, English (U.S.)
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
nồng độ pha loãng trang ở 3 đĩa petri môi trƣờng MRS. Bao gói các đĩa sau khi đã trang nuôi ở 370C, 48 giờ.
Kiểm tra sự xuất hiện các khuẩn lạc trên đĩa petri, tách và thuần khiết các khuẩn lạc có vòng trong suốt xung quanh (axít phân giải CaCO3 tạo vòng trong). Nhận dạng các khuẩn lạc này bằng đặc điểm hình thái tế bào, nhuộm Gram, thử phản ứng catalase. Các vi khuẩn thuộc nhóm Lactobacillus thì cấy chuyển sang đĩa petri mới bằng phƣơng pháp cấy ria để thuần giống. Khi đã thuần ta tiến hành giữ giống trong ống nghiệm môi trƣờng MRS thạch nghiêng hoặc trong môi trƣờng MRS lỏng có bổ sung 40% glyxerol và bảo quản ở 800
C (Yavuzdurmaz, 2007) [68].
*Phương pháp thử nghiệm catalaza
Thuốc thử: dung dịch 3% H2O2 (hydrogen peroxide)
Nguyên tắc: Các vi sinh vật hiếu khí và kị khí tùy ý chứa chuỗi truyền điện tử có xytochrome đều có enzyme catalase (trừ Streptococcus spp.).
Catalase thủy phân H2O2 thành H2O và O2 (đƣợc ghi nhận qua hiện tƣợng sủi bọt khí).
Tiến hành: Dung dịch H2O2 3% cần đƣợc giữ lạnh trong chai màu nâu, tránh ánh sáng, dung dịch đệm photphate pH 7,0. Nhỏ một giọt H2O2 3% lên sinh khối vi sinh vật trên đĩa môi trƣờng nuôi cấy chủng vi sinh vật thuần cần kiểm tra. Ghi nhận sự sủi bọt nếu có.
Kết quả: Thử nghiệm là (+) khi có hiện tƣợng sủi bọt khí do O2 đƣợc tạo ra, ngƣợc lại là (-) khi không có sự sủi bọt khí. Vi khuẩn Lactobacilllus spp.cho phản ứng catalase âm tính (Yavuzdurmaz, 2007) [74].
* Phương pháp nhuộm Gram
Nguyên tắc: Nhuộm Gram có vai trò đặc biệt quan trọng trong việc phân loại vi khuẩn. Trong quá trình nhuộm Gram, tế bào bƣớc đầu đƣợc xử lý với tím kết tinh và iot nên có sự tạo thành phức chất tím kết tinh iốt bên trong tế bào. Khi vi khuẩn Gram âm bị tẩy cồn, lipit của lớp màng ngoài bị hòa tan làm tăng tính thấm của màng dẫn đến sự rửa trôi phức chất tím-iốt và làm cho vi khuẩn mất màu. Khi nhuộm bổ sung chúng sẽ bắt màu với thuốc (đỏ vàng với
Safranin hay đỏ tía với Fuchsin). Ở vi khuẩn Gram dƣơng, cồn làm cho các lỗ trong peptidoglycan co lại do đó phức chất tím - iốt bị giữ lại bên trong tế bào.
Tiến hành: Lấy một giọt nƣớc cất vô trùng nhỏ lên lam kính. Dùng que cấy vòng lấy mẫu. Hòa mẫu vào giọt nƣớc và dàn đều trên lam kính có đƣờng kính khoảng 1-2cm. Cố định tiêu bản trên ngọn lửa đèn cồn. Nhuộm bằng dung dịch tím kết tinh (crystal violet) trong khoảng 1 phút, rửa bằng nƣớc. Nhuộm tiếp bằng dung dịch lugol trong 1 phút, rửa lại bằng nƣớc. Tẩy màu bằng dung dịch etanol (etanol 95% - axeton 1:1) trong 30 giây. Sau đó nhuộm tiếp bằng safranin trong 30 giây, rửa qua nƣớc, thấm khô. Nhỏ dầu lên tiêu bản và quan sát dƣới kính hiển vi điện tử ở vật kính dầu 100X.
Kết quả: Khi soi dƣới kính hiển vi điện tử vi khuẩn Gram dƣơng có màu tím, vi khuẩn Gram âm có màu hồng (Nguyễn Lân Dũng và cs 1972) [6].
* Phương pháp thử khả năng di động
Nguyên tắc: Vi sinh vật di động nhờ cấu trúc protein gọi là tiên mao (flagella) có ở nhiều vi khuẩn thuộc giống trực khuẩn và cầu trực khuẩn. Khả năng di động là một trong những căn cứ để phân biệt vi sinh vật. Khả năng này có thể đƣợc quan sát dựa vào sự tăng trƣởng và di động của vi sinh vật bên trong môi trƣờng thạch mềm.
Tiến hành: Sử dụng môi trƣờng bán lỏng (MRS có bổ sung agar 8g/l). Môi trƣờng đƣợc đun tan, phân phối thành dung tích 5ml vào các ống nghiệm vô trùng, hấp khử trùng ở 1210C trong vòng 15 phút. Các ống môi trƣờng này đƣợc làm nguội ở trạng thái đứng và bảo quản ở 4-100C. Dùng que cấy thẳng thu lấy sinh khối từ khuẩn lạc của chủng thuần. Chủng đƣợc cấy bằng cách đâm sâu đầu que cấy xuyên vào giữa môi trƣờng trong ống nghiệm đến độ sâu khoảng 2/3 môi trƣờng. Các ống môi trƣờng đƣợc ủ ở 370
C trong 24-48h. Kết quả: Thử nghiệm là (+) vi khuẩn có khả năng di động khi vi sinh vật mọc lan ra khỏi đƣờng cấy và làm đục môi trƣờng xung quanh; là (-) vi khuẩn không có khả năng di động khi vi sinh vật chỉ mọc dọc theo đƣờng cấy trong khi môi trƣờng xung quanh vẫn trong (Nguyễn Lân Dũng và cs 1972) [6].
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
* Phương pháp định lượng vi khuẩn lactic
Chọn các nồng độ pha loãng mà số lƣợng khuẩn lạc mọc trên môi trƣờng thạch không quá 150 khuẩn lạc. Tiến hành đếm số lƣợng khuẩn lạc ở 2 nồng độ pha loãng liên tiếp. Từ đó tính toán giá trị khuẩn lạc trung bình.
Tính kết quả:
Để xác định tổng số vi khuẩn lactic có trong 1g (1ml) mẫu kiểm nghiệm, chọn những đĩa có không quá 150 khuẩn lạc của 2 đậm độ pha loãng liên tiếp. Sự phân bố các khuẩn lạc phải hợp lý: Độ pha loãng càng cao thì số khuẩn lạc càng ít. Tổng số vi khuẩn Lactic có trong 1g hoặc 1ml mẫu thử (N) đƣợc tính theo công thức sau:
( C
N = ---
Vx( n1+ 0,1xn2 )d Trong đó:
C : Tổng số khuẩn lạc đếm đƣợc trên tất cảcác đĩa đã chọn. V : Thể tích cấy trên mỗi đĩa tính bằng ml
n1 : Số đĩa của đậm độ pha loãng thứ nhất đƣợc giữ lại n2 : Số đĩa của đậm độ pha loãng thứ hai đƣợc giữ lại
d : Hệ số pha loãng của đậm độ pha loãng thứ nhất
*Phương pháp định lượng axít lactic được sinh ra (TCVN 5860–1994)
Tiến hành: Lấy 10ml dịch lên men ly tâm ở 8000 vòng/phút trong 7 phút
loại bỏ sinh khối tế bào, bổ sung 20ml nƣớc cất và thêm 2 giọt phenolphthalein. Sau đó chuẩn độ bằng NaOH 0,1N đến khi xuất hiện màu hồng nhạt bền trong 30 giây. Xác định thể tích NaOH 0,1N (ml) đã sử dụng cho chuẩn độ. Độ axít đƣợc tính bằng công thức sau:
% axít lactic = VNaOH x 0,009 (g/l)
(1 ml dung dịch NaOH tƣơng đƣơng 0,009g axít lactic)
2.3.1.2. Phương pháp xác định một số đặc tính probiotic củachủng vi khuẩn phân lập được trong điều kiện in vitro
* Phương pháp đánh giá khả năng tồn tại trong môi trường pH axít thấp và pH kiềm
Pha chế đệm PBS dạng lỏng và phân phối đồng đều ra 5 bình tam giác có dung tích 100ml, điều chỉnh pH dung dịch đệm ở ngƣỡng 2; 3 và 8 bằng dung dịch HCl 30% và NaOH 1M. Tiến hành khử trùng ở 1210C trong 15 phút.
Các chủng vi khuẩn lactic đƣợc nuôi lắc 250vòng/phút ở 370C trong 24h. Thu dịch nuôi ly tâm thu cặn tế bào ở 9000vòng/phút trong 7 phút, rửa 2 lần bằng đệm PBS 7,2; bổ sung 200µl vào các bình tam giác có chứa đệm PBS có pH lần lƣợt là 2; 3 và 8 lắc đều trong vòng 3 phút. Thu dịch tiến hành đo OD600nm và định lƣợng số lƣợng tế bào vi khuẩn lactic ở các thời điểm T0, T1,5, T3 tƣơng ứng với các thời điểm 0h; 1,5h và 3h (Sahadeva R.P.K và cs 2011) [58].
* Phương pháp đánh giá khả năng chống chịu trong muối mật
Bổ sung vào 100ml môi trƣờng MRS với các nồng độ muối mật 0,3%, khử trùng ở 121o
C trong 15 phút. Hút 1000µl dịch nuôi các chủng vi khuẩn lactic đƣợc hoạt hóa 24h vào các bình thí nghiệm ở các nồng độ muối mật khác nhau. Đếm mật độ tế bào ở các thời điểmT0, T1, T2, T3, T4 thí nghiệm (Hoque M.Z và cs 2010) [54].
* Phương pháp xác định khả năng ức chế chủng vi khuẩn kiểm định
Hoạt tính kháng khuẩn của chủng Lactobacillus đƣợc xác định bằng
phƣơng pháp đục lỗ thạch nhƣ sau: cấy trải chủng vi khuẩn kiểm định trên môi trƣờng MPA dạng thạch, sau đó tiến hành đục lỗ thạch. Nhỏ 100μl dịch nuôi cấy đã loại bỏ cặn tế bào của chủng vi khuẩn lactic (dịch nuôi cấy đã đƣợc trung hòa về pH=7 bằng NaOH 0,1N) vào lỗ đã đục, để ở 40
C trong 6h, sau đó chuyển các đĩa thạch này sang 370C trong 24h. Sau 24h, tiến hành đo vòng kháng khuẩn đƣợc hình thành (Nguyễn Lân Dũng và cs 1972 [6]). Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng vi sinh vật tuyển chọn đƣợc tính bằng đƣờng kính vòng vô khuẩn ∆D:
∆D = D – d (mm) Trong đó:
∆D: Đƣờng kính thực của vòng vô khuẩn (mm)
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
d: Đƣờng kính lỗ thạch (10 mm).
2.3.2. Phương pháp chế tạo chế phẩm và kiểm tra chất lượng của chế phẩm
2.3.2.1. Chế tạo chế phẩm
Lactovet là chế phẩm đƣợc chế tạo từ chủng Lactobacillus plantarum TL4 và các chất phụ gia
Bảng 2.2: Tiêu chuẩn cơ sở của sản phẩm Lactovet trong 1kg thành phẩm
TT Chỉ tiêu ĐV tính Mức chất lƣợng
1 Độ ẩm (max) % 10
2 Lactobacillus plantarum TL4 CFU/g 1011
3 Chất mang tá dƣợc Vừa đủ 0,5 kg
Không có kháng sinh và hóa chất độc hại Quy trình chế tạo chế phẩm Lactovet:
Từ chủng Lactobacillus plantarum TL4 (trình tự gen mã hóa ARNr 16S