3. VẬT LIỆU, đỊA đIỂM, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2.2. Phương pháp khử trùng dụng cụ và nuôi cấy nấm trong phòng thắ nghiệm
3.2.2.1. Phương pháp khử trùng dụng cụ
Các dụng cụ bằng thuỷ tinh như: ống nghiệm, bình tam giác, hộp petri ựược khử trùng bằng hơi nước nóng ở nhiệt ựộ 1610C trong 3h bằng tủ sấy. Dao kẹp, que cấy ựược khử trùng trên ngọn lửa ựèn cồn. Môi trường nuôi cấy ựược khử trùng trong nước nóng ở 1210C, 1,5 atm từ 35 - 45 phút trong nồi hấp.
3.2.2.2. Phương pháp nấu môi trường
Tạo môi trường WA 2% (Warter Agar) :
- Thành phần:
Agar : 20 g
Nước cất : 1000 ml
- Cách ựiều chế: Cân 20 g agar cho vào nồi ựun sôi, sau ựó ựổ vào bình tam giác (lọ thuỷ tinh), tiếp ựó cho thêm nước ựể ựược 1000 ml.
Môi trường WA nghèo dinh dưỡng, khó bị tạp nên dùng ựể cấy phân lập mẫu bệnh.
Tạo môi trường PGA (Potato Glucoza Agar):
- Thành phần: Khoai tây : 250 g Glucoza : 20 g Agar : 20 g Nước cất : 1000 ml - Cách ựiều chế :
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 22
Cân 250 g khoai tây ựã ựược rửa sạch, thái lát mỏng hình vuông, cho vào nồi cùng 1 ắt nước cất rồi ựun sôi. Sau khi ựun sôi ựược khoảng 30 phút, lọc lấy phần dịch nước chiết, bổ sung thêm nước cất cho ựủ 1000 ml.
Pha dung dịch nước trên với 20 g ựường và 20 g thạch rau câu, cho vào bình tam giác và lắc ựều ựể tạo thành dung dịch ựồng nhất. Môi trường ựược ựưa vào bình thuỷ tinh sau ựó ựem hấp vô trùng ở 1210C tại 1,5 atm trong thời
gian 30 phút. Sau ựó ựể nguội tới khoảng 550C rồi ựưa vào buồng cấy ựể rót
vào ựĩa petri ựã ựược sấy khử trùng.
Môi trường này giàu dinh dưỡng, dễ bị tạp, dùng làm môi trường cấy truyền cho các loại nấm sau khi ựã ựược cấy phân lập và làm thuần nấm.
Tạo môi trường PCA (Potato Carrot Agar):
- Thành phần : Khoai tây : 20 g Cà rôt : 20 g Agar : 20 g Nước cất : 1000 ml - Cách ựiều chế :
Giống như ựiều chế môi trường PGA, dùng ựể nuôi cấy nấm ựã ựược phân lập từ môi trường WA nhằm nghiên cứu ựặc ựiểm hình thái sinh học của nấm.
Tạo môi trường CA (Carrot Agar):
- Thành phần:
Cà rôt : 200 g
Agar : 20 g
Nước cất : 1000 ml
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 23
Tương tự như môi trường PGA, dùng ựể nuôi cấy nấm ựã ựược phân lập từ môi trường WA nhằm nghiên cứu ựặc ựiểm hình thái sinh học của nấm.
Tạo môi trường CLA (Carnation leaf Agar):
- Thành phần:
Lá cẩm chướng
Agar : 20 g
Nước cất : 1000 ml
- Cách ựiều chế :
Lá cẩm chướng ựược lấy từ những lá tươi không có tàn dư của các thuốc trừ sâu bệnh, ngay sau khi thu hái lá lúa ựược cắt thành từng mẩu nhỏ 3 Ờ 5 mm và ựược sấy khô bằng tủ sấy tại nhiệt ựộ 3 Ờ 4 giờ cho ựến khi khô kiệt. Sau ựó ựóng gói các mẫu lá cẩm chướng trong túi giấy thiếc hoặc nilon và ựược khủ trùng trong nồi hấp.
Nước cất ựun sôi, cho Agar vào khuấy ựều cho tan hết. đổ môi trường vào bình, hấp ở ựiều kiện 1210C; 1,5 atm trong thời gian 45 phút. để nguội, ựổ vào các ựĩa Petri vô trùng ựã có sẵn 3 Ờ 4 mẩu lá cẩm chướng.
Nhiều loại nấm sinh bào tử trên môi trường này trong vòng 6 - 10 ngày. Trên môi trường này, hình thái những bào tử vô tắnh ựồng nhất hơn so với khi dùng môi trường nhiều hydrat cacbon như PGA. Sử dụng môi trường này ựể xác ựịnh loại nấm gây hại cây trồng vì bào tử hình thành trên lá cẩm chướng có hình dạng và chiều dài ổn ựịnh so với bào tử hình thành ựơn ựộc từ cành bào tử phân sinh trên sợi nấm trong môi trường khác (Trần Nguyễn Hà và CTV, 2005).