3. VẬT LIỆU, đỊA đIỂM, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2.1. Nghiên cứu, xác ựịnh thành phần nấm hại trên hạt thóc giống
3.2.1.1. Phương pháp lấy mẫu
Mỗi mẫu hạt ựược dàn ựều trên khay, lấy hạt ngẫu nhiên theo phương pháp 5 ựiểm chéo góc.
3.2.1.2. Phương pháp kiểm nghiệm hạt giống Sử dụng phương pháp giấy thấm:
Theo phương thức của ISTA (International Seed Testing Association, 2003)
+ Lấy 300 hạt/1 mẫu (chia 3 lần nhắc lại, mỗi lần 100 hạt), chia thành 12 phần, mỗi phần 25 hạt.
+ Chuẩn bị ựĩa Petri và giấy thấm (Blotter paper) ựường kắnh 9cm, lấy 12 ựĩa/ mẫu. Hộp petri rửa sạch, khử trùng bằng cồn.
+ Lấy 3 tờ giấy thấm nhúng vào nước cất sao cho toàn bộ giấy thấm ựược thấm ướt ựều, sau ựó ựặt vào hộp Petri (3 tờ/ hộp).
+ Cách ựặt hạt: đặt 25 hạt/ ựĩa Petri, ựặt thành 3 vòng. Vòng ngoài 15 hạt, vòng giữa 9 hạt, và 1 hạt trung tâm của ựĩa, khoảng cách giữa các hạt và các vòng bằng nhau. Sau khi ựặt xong ghi mã số hoặc tên mẫu giống, ngày ựặt và ngày kiểm tra trên mặt ựĩa. để mẫu hạt trong ựiều kiện nuôi cấy: nhiệt ựộ
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 20
thắch hợp 20 Ờ 25 oC, ánh sáng ựèn huỳnh quang hoặc ựèn cực tắm, chiếu sáng 12 giờ tối xen kẽ 12 giờ sáng. Sau 7 ngày ựem kiểm tra hạt dưới kắnh hiển vi soi nổi, soi lần lượt từ vòng ngoài vào vòng trong tâm ựĩa. Dùng que khêu nấm ra lam kắnh ựể soi, quan sát hình thái, màu sắc của bào tử phân sinh ựể xác ựịnh thành phần nấm bệnh.
Sau khi kiểm tra tiến hành ựếm số hạt nhiễm bệnh do nấm Fusarium
spp., từ ựó tắnh tỷ lệ hạt bị nhiễm bệnh.
- Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ nhiễm nấm (%). Mức ựộ nhiễm nấm
Fusarium spp. trên các mẫu hạt giống và hạt thương phẩm. So sánh mức ựộ nhiễm giữa 2 mẫu này.
3.2.1.3. Phương pháp phân lập, giám ựịnh mẫu hạt thóc bị bệnh
- Phân lập các nấm từ hạt thóc bị bệnh theo phương phương pháp phân lập trên môi trường nhân tạo (Agar plate method). Môi trường ựược dùng ựể phân lập nấm là môi trường WA, CLA.
Sau khi thu ựược mẫu hạt thóc bị bệnh, dùng cồn 700 khử trùng bề mặt hạt trong vòng 10 - 15 phút, cho những hạt ựã khử trùng vào ống nghiệm ựựng 10 ml nước cất vô trùng (mỗi một ống nghiệm chỉ bỏ ựược tối ựa là 25 hạt). Ngâm hạt trong nước cất vô trùng khoảng 12 giờ. Sau ựó gạn hết nước, dùng giấy thấm vô trùng thấm khô hạt. đặt hạt lên môi trường WA, mỗi ựĩa ựặt 25 hạt, ựặt hạt theo vòng tròn. để ựĩa môi trường ựã cấy hạt dưới dàn ựèn trong phòng nuôi cấy nấm.
- Giám ựịnh nấm: Môi trường dùng ựể giám ựịnh nấm là môi trường CLA, PGA
Hạt thóc bị bệnh cấy trên môi trường WA, quan sát thấy sợi nấm bắt ựầu xuất hiện trên bề mặt môi trường và bề mặt hạt, dùng que cấy vô trùng cắt phần ựỉnh của sợi nấm chuyển sang môi trường mới Ờ môi trường thắch hợp cho nấm (PGA, CLA). Môi trường CLA là môi trường kắch thắch sinh bào tử của một số nấm gây bệnh. Còn môi trường PGA kắch thắch sợi nấm phát triển
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 21
ta có thể xem màu sắc tản nấm, cách mọc của sợi nấm.
Khi bào tử xuất hiện trên môi trường CLA, dùng que cấy khều một ắt bào tử của nấm ựó ra một chiếc lam kắnh sạch, ựậy lamen rồi ựưa lên kinh hiển vi quan sát và giám ựịnh.