Trong vài năm trở lại đây, hướng nghiên cứu đa hình phân tử tằm dâu ở Việt Nam bắt đầu được quan tâm và đẩy mạnh, trong đó đáng chú ý là những kết quả
Nguyễn Thị Lan 36
nghiên cứu của Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Nguyễn Thị Thanh Bình, Hoàng Thị Hằng, Nông Văn Hải (2004) sử dụng kỹ thuật RAPD nghiên cứu đa hình 8 giống tằm dâu Việt Nam với 5 mồi ngẫu nhiên. Kết quả phân tích cho thấy có 41/67 PĐ đa hình (chiếm 61,2%). HSTĐDT giữa các giống thay đổi từ 0,547 đến 0,984 [2].
Nguyễn Thị Minh Nguyệt, Trịnh Hữu Hằng, Nguyễn Thị Thanh Bình
(2004, 2005) dùng 5 mồi RAPD phân tích đa hình phân tử 10 giống tằm lưỡng hệ. Kết quả thu được 200 PĐ, trong đó có 120 PĐ đa hình (chiếm 60%). HSTĐDT giữa các giống dao động từ 0,54 đến 0,91, có thể tham khảo trong nhóm cặp lai [14].
Nguyễn Thị Thanh Bình, Đinh Thị Ngọc Thuý, Ngô Lê Thương, Trịnh Hữu Hằng (2005) sử dụng kỹ thuật RAPD với 10 mồi ngẫu nhiên phân tích đa hình phân tử 10 giống tằm lưỡng hệ kén trắng đã thu được 394/674 PĐ đa hình chiếm 58,46%. Chín trên mười mồi cho đa hình với giá trị PIC từ 0,26 đến 0,47 và khoảng cách di truyền giữa các giống tằm dao động trong khoảng 0,0268 đến 0,1686 trung bình đạt 0,30 [4].
Nguyễn Thị Thanh Bình, Đinh Thị Ngọc Thuý, Trần Thị Bích Hồng (2007)
Nghiên cứu đa dạng di truyền và ưu thế lai của một số giống tằm dâu Bombyx mori
L. bằng CTPT. Sử dụng kỹ thuật PCR-RAPD đánh giá tính đa dạng di truyền của 10 giống tằm lưỡng hệ kén trắng với 24 đoạn mồi ngẫu nhiên. Kết quả cho 12716/17259 PĐ đa hình chiếm 74,11%. Dựa vào sự khác biệt di truyền phân chia các giống tằm thành 3 nhóm ưu thế lai, 6 cặp lai được dự đoán có khả năng cho ưu thế lai cao trong đó có 2 cặp lai đã được kiểm nghiệm [5].
Đặng Đình Đàn, Nguyễn Thị Thanh Bình (2008) kết hợp giữa phương pháp truyền thống với kỹ thuật ISSR sử dụng 5 mồi ISSR phân tích tương quan di truyền của 10 giống tằm và các tổ hợp lai đang chọn tạo, xác định hệ số tương đồng di truyền trong khoảng 0,6 đến 0,9. Xác định độ thuần của giống và tổ hợp lai dao
Nguyễn Thị Lan 37
động trong khoảng 69,95% đến 89,72%. Kết quả nhận được về độ thuần tương đương với cách đánh giá bằng phương pháp truyền thống [10].
Nguyễn Thị Thanh Bình, Đinh Thị Ngọc Thuý (2008) sử dụng kỹ thuật ISSR trên cơ sở nghiên cứu genome của 30 giống tằm thuộc 2 nhóm có năng suất, chất lượng tơ kén và sức sống khác nhau với 15 mồi ISSR đã xác định được chỉ thị S5.1500, S2.700 và phân đoạn L13.800bp liên quan đến giống có chất lượng tơ kén thấp nhưng sức sống và khả năng chống chịu cao. Tách dòng và xác định trình tự của phân đoạn L13.800bp, thiết kế mồi và nhân thành công phân đoạn đặc hiệu L13.800bp liên quan đến chất lượng tơ kén và sức sống của giống để sử dụng trong chọn tạo giống [6].
Năm 2008, Nguyễn Thị thanh Bình và Đinh Thị Ngọc Thúy đã sử dụng 15 mồi ISSR phân tích genome của 30 giống tằm thuộc hai giống có năng suất và chất lượng tơ kén cao thấp khác nhau, xác định được chỉ thị S12 – 2100 liên quan đến năng suất cao của giống. Nhóm tác giả đã sử dụng thành công kỹ thuật SCAR, tách dòng và xác định trình tự phân đoạn liên quan, so sánh trên ngân hàng gen có độ tương đồng cao nhất là 94,58%, thấp nhất là 86,91% [7].
Đinh Thị Phòng và cs (2009), tiến hành đánh giá độ thuần của 10 giống tằm
(Bombyx mori L.) bằng chỉ thị RAPD. Kết quả nhận được cho thấy tỉ lệ phần trăm phân đoạn DNA đồng hình nằm trong phạm vi từ 68,63% (giống GQ11) đến 91,66% (giống GQ13). Tổng số phân đoạn DNA nhân bản của 10 giống tằm là 333. Số phân đoạn DNA nhân bản của 10 giống tằm khi phân tích với 10 chỉ thị RAPD dao động từ 20 (OPN05) đối với giống GQ14 đến 51 (OPP19) đối với giống GQ15. Số lượng các phân đoạn DNA nhân bản với mỗi mồi xê dịch từ 1 đến 11 phân đoạn [15].
Vũ Thị Thu Hiền và cs (2010) sử dụng chỉ thị RAPD phân tích tính đa hình
DNA của 8 cặp lai nhị nguyên tằm dâu F1 (nguyên liệu là 80 mẫu nhộng F1 của các
cặp lai nhị nguyên tằm dâu và 15 mồi ngẫu nhiên). Kết quả thu được cho thấy: có 12/15 mồi có tính đa hình với giá trị PIC dao động từ 0,07 (OPV6) đến 0,51
Nguyễn Thị Lan 38
(OPP19), trong phạm vi vùng phân tích có 99 phân đoạn DNA được nhân bản, có 83 phân đoạn đa hình (chiếm 83,84%) va 16 phân đoạn đơn hình (chiếm 16,16%), số lượng các phân đoạn DNA dao động từ 1 đến 9 với kích thước trong khoảng
200bp đến 1600bp. Ngoài ra hệ số tương đồng di truyền của các con lai F1 dao động
trong khoảng 0,33 – 1,00 và được chia làm 2 nhánh chính: nhánh 1 gồm các con lai
F1 của 4 cặp nhị nguyên trong nước (hệ số tương đồng di truyền 0,734 – 1,00),
nhánh 2 bao gồm các con lai F1 của 4 cặp lai nhị nguyên nhập ngoại (hệ số tương
đồng di truyền từ 0,503 – 0,734) [11].
Đinh Thị Ngọc Thúy, Nguyễn Thị Thanh Bình (2010) tiến hành nghiên cứu phát triển chỉ thị PCR – ISSR liên quan với năng suất chất lượng tơ kén tằm dâu (Bombyx mori L.). Trong nghiên cứu này, từ kết quả phân tích đa hình ISSR trên các giống tằm có năng suất và chất lượng tơ kén khác nhau của Nguyễn Thị Thanh Bình và cộng sự (2008), nhóm tác giả đã tìm thấy hai phân đoạn liên quan đến năng
suất, chất lượng kén của giống là ISSR1 và ISSR2. Hai phân đoạn này đã được tách
dòng và xác định trình tự. Từ kết quả đọc trình tự, sử dụng phần mềm primer 3, hai cặp mồi đặc hiệu đã được thiết kế và sử dụng để kiểm tra trên 22 giống tằm nguyên liệu của Trung tâm Nghiên cứu Thực nghiệm Nông Lâm nghiệp Lâm Đồng. Phân
đoạn ISSR2 được khuếch đại 100% ở những giống có năng suất kén cao, còn phân
đoạn ISSR1 xuất hiện trên 86,7% những giống cho chất lượng tơ tốt. Kết quả đánh
giá bằng chỉ thị PCR – ISSR phù hợp với số liệu đánh giá của đơn vị cung cấp mẫu. Các tác giả cũng kết luận việc đánh giá giống bằng makers phân tử sẽ rút ngắn đáng kể về thời gian so với phương pháp truyền thống [19].
Nguyễn Thị Lan 39
CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu
2.1.1. Các giống tằm
Nguyên liệu sử dụng trong phân tích đa hình phân tử là 30 giống tằm, trong đó 20 giống tằm lưỡng hệ kén trắng được kí hiệu là I, IV, C1, C3, G1, G3, M3, M4, V9, V11 thuộc hệ kén Trung Quốc có sức sống tốt và năng suất kén cao, các giống: II, III, C5, C7, G2, G4, M1, M5, V5, V7 thuộc hệ kén Nhật Bản có năng suất kén cao và chất lượng tơ kén tốt, 10 giống đa hệ kén vàng được kí hiệu S1 đến S10 có khả năng chống chịu ẩm nhiệt độ cao, nhưng năng suất chất lượng tơ kén thấp (bảng 1).
Các giống tằm đa hệ Các giống tằm lƣỡng hệ
Hệ Trung Quốc Hệ Nhật bản
TT Ký hiệu mẫu giống TT Ký hiệu mẫu giống TT Ký hiệu mẫu giống
1 S1 1 I 11 II 2 S2 2 IV 12 III 3 S3 3 C1 13 C5 4 S4 4 C3 14 C7 5 S5 5 G1 15 G2 6 S6 6 G3 16 G4 7 S7 7 M3 17 M1 8 S8 8 M4 18 M5 9 S9 9 V9 19 V5 10 S10 10 V11 20 V7
Nguyễn Thị Lan 40
Nguyên liệu sử dụng trong nghiên cứu phát triển chỉ thị là 10 giống tằm, trong đó 5 giống bản địa đa hệ và 5 giống lưỡng hệ (bảng 2) và các cặp lai tam nguyên gồm giống mẹ thuộc đa hệ và bố là F1 nhị nguyên của 2 giống lưỡng hệ.
Các giống tằm đa hệ là giống bản địa được nuôi từ trên 30 năm trước ở Việt Nam, đây là những giống có khả năng chống chịu trong điều kiện ẩm độ, nhiệt độ cao nên nuôi được cả trong vụ hè, tuy chúng có năng suất chất lượng tơ kén thấp, được Trung tâm Nghiên cứu Dâu tằm tơ Trung ương cung cấp.
Còn các giống tằm lưỡng hệ mới được lai tạo trong thời gian gần đây, chúng có năng suất chất lượng tơ kén cao hơn hẳn các giống tằm đa hệ bản địa, nhưng chỉ nuôi được trong vụ xuân và vụ thu mà không thể nuôi được trong vụ hè do không có khả năng chống chịu nóng ẩm cao. Các mẫu giống này được thu thập từ Trung tâm Nghiên cứu Thực nghiệm Nông Lâm nghiệp Lâm Đồng.
Mẫu của các giống tằm lưỡng hệ nhận vào vụ thu, các giống đa hệ bản địa thu thập trong vụ hè, ở thời kì nhộng ngày thứ 5, mỗi giống 30 cá thể và được lấy hoàn toàn ngẫu nhiên.
Bảng 2: Tên và kí hiệu các giống tằm trong nghiên cứu phát triển chỉ thị
STT Tên giống Kí hiệu STT Tên giống Kí hiệu
1 Trắng Hà Tĩnh THT 6 O1 O1
2 Đồ Sơn Khoang ĐSK 7 O2 O2
3 Tằm Mắt TM 8 A1 A1
4 Hoàng Liên Sơn HLS 9 A2 A2
Nguyễn Thị Lan 41
2.1.2. Mồi sử dụng
Thực hiện đề tài, chúng tôi sử dụng 15 mồi ISSR được đặt mua của hãng
Invitrogen (Mỹ). Trình tự của các mồi được trình bày trên bảng 3.
Bảng 3. Trình tự các mồi ISSR
STT Tên mồi Kích thƣớc ƣớc
tính các PĐ (bp) Trình tự mồi (5’-3’)
1 P1 650 – 2100 AGA GAG AGA GAG AGA GT
2 P2 700 -2100 CTC TCT CTC TCT CTC AT
3 P3 400 -2500 TCT CTC TCT CTC TCT CA
4 P4 600 – 3500 TGT GTG TGT GTG TGT GC
5 P5 500 – 1500 AGA GAG AGA GAG AGA GG
6 P6 550 – 3500 ACA CAC ACA CAC ACA CAG
7 P7 700 – 3000 GTG TGT GTG TGT GTG GTG
8 P8 400 – 1900 ACA CAC ACA CAC ACA CTG
9 P9 700 – 2250 AGC AGC AGC AGC AGC AGC
10 P10 500 – 3200 ACC ACC ACC ACC ACC ACC
11 P11 800 – 3000 CAC ACA CAC ACA CAC AGG
12 P12 600 – 2500 GGG TGG GGT GGG GTG
13 L11 750 – 3200 TCT CTC TCT CTC TCT CC
14 L13 800 – 3000 CTC TCT CTC TCT CTC TGC
15 T1 650 – 3500 ATA TAT ATA TAT ATA TGC
2.1.3. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất
Trang thiết bị, dụng cụ, hoá chất dùng trong các thí nghiệm của đề tài được trình bày trong bảng 4 và bảng 5:
Nguyễn Thị Lan 42
Bảng 4. Các trang thiết bị và dụng cụ sử dụng
STT Thiết bị, dụng cụ Hãng sản xuất
1 Bộ cối chày sứ Trung Quốc
2 Bộ điện di Mupid – ex (Nhật)
3 Bế ổn nhiệt OSI (Pháp)
4 Cân phân tích Mettler (Thụy Sỹ)
5 Hệ thống chụp ảnh gel Biolads (Mỹ)
6 Lò vi sóng Sam sung (Nhật)
7 Máy chu trình nhiệt PCR Eppendorf (Đức)
8 Máy đo quang phổ kế Hewlett Packard (Mỹ)
9 Máy khuấy từ OSI (Đức)
10 Máy ly tâm lạnh Sorvall (Mỹ)
11 Máy voltex Rotolab OSI (Đức)
12 Máy soi DNA Biolads (Mỹ)
13 Máy hút chân không Speed Vac Se 1100A-Savant
14 Nồi khử trùng và tủ sấy Nhật Bản
15 Pipettman, đầu côn các loại Eppendorf (Đức)
16 Tủ cấy vô trùng Sanyo (Nhật)
17 Tủ lạnh -800
C, -200C, 40C Sanyo (Nhật)
Nguyễn Thị Lan 43
Bảng 5. Các loại hóa chất sử dụng trong thí nghiệm
STT Tên hóa chất Hãng sản xuất
1 Nitơ lỏng Việt Nam
2 Bộ hóa chất tách DNA Sigma – Aldrich (Mỹ)
3 Bộ hóa chất chạy PCR Fermentas (Mỹ)
4 Cồn 70% và 100% Merck (Đức)
5 Hóa chất điện di DNA Biolads (Mỹ)
6 Nước khử ion vô trùng Fermentas (Mỹ)
7 Make 1Kb, 100bp Fermentas (Mỹ)
8 Bộ Kit thôi gel QiAGen (Anh)
9 LB lỏng, đặc Biolads (Mỹ)
10 Dung dịch Sol I, II, III Fermentas (Mỹ)
11 Các enzyme cắt, T4 ligase Fermentas (Mỹ)
12 Vector Pjet 1.2 Fermentas (Mỹ)
13 Một số hóa chất khác
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số
Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng phương pháp tách chiết và tinh sạch DNA theo tài liệu của Wiliam và cộng sự, tham khảo thêm tài liệu của một số tác giả khác, có cải tiến cho phù hợp với đối tượng nghiên cứu và điều kiện phòng thí nghiệm.
Nguyễn Thị Lan 44
Nghiền khoảng 100mg mẫu mô nhộng thành dạng bột mịn, sau đó cho khoảng 900µl lysis cell solution và chuyển mẫu sang ống eppendorf khác.
Bổ sung 8µl proteinase K (20mg/ml) rồi đảo đều và ủ mẫu qua đêm ở nhiệt độ 560C. Đây là nhiệt độ tối ưu cho proteinase K hoạt động. Hỗn hợp lysis cell solution và proteinase K sẽ phá vỡ màng tế bào và màng nhân, giải phóng DNA ra môi trường đồng thời phân huỷ các protein liên kết với DNA.
Bổ sung tiếp 4,5µl RNase (20mg/ml) để loại bỏ ARN. Đảo đều và ủ mẫu ở
370C trong khoảng 2 - 3h, đây là nhiệt độ hoạt động tối ưu của RNase.
Bổ sung 450µl muối CH3COONH4 (7,5M) đảo đều và tủa trong lạnh khoảng
2h - 3h. Protein sẽ được loại bỏ khỏi dung dịch dưới dạng tủa.
Ly tâm 13000 vòng/phút trong 15 phút. Bỏ tủa, hút dịch trong sang ống eppenforf mới.
Bổ sung 450µl phenol: choroform: isoamyl alcohol (25:24:1), dung dịch này có tác dụng làm biến tính protein nhưng không hoà tan DNA. Lắc đều và ly tâm mẫu 13000 vòng/phút trong 20 phút. Khi đó protein biến tính sẽ tủa thành một lớp nằm giữa pha dịch DNA và pha phenol: choroform: isoamyl alcohol. Pha nước có chứa DNA sẽ được thu nhận lại bằng cách hút chuyển dịch sang ống eppendorf mới.
Bổ sung 450µl chloroform: isoamyl alcohol rồi tiến hành các bước giống như khi cho phenol: chloroform vào. Cuối cùng thu được dịch chứa DNA.
Dịch DNA thu được ở trên cho vào eppendorf chứa 850µl ethanol 100% và
40µl CH3COONa, đảo đều và để tủa trong ngăn đá qua đêm.
Ly tâm 13000vòng/phút trong 20 phút, thu tủa DNA.
Rửa trong 400µl cồn 70% để loại bỏ muối và chloroform: isoamyl alcohol còn sót lại trong mẫu.
Nguyễn Thị Lan 45
Bảo quản DNA trong TE ở -200C
2.2.2. Định lƣợng DNA bằng quang phổ kế
Sau khi thu nhận DNA ở dạng sạch, tiếp tục tiến hành phân tích định tính và định lượng DNA bằng quang phổ kế.
Nguyên tắc của phương pháp quang phổ kế
Phương pháp định lượng DNA bằng quang phổ kế dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng λ = 260nm của các bazơ purine và pyrimidine. Dựa trên nguyên tắc này, cho phép xác định được nồng độ và độ tinh sạch của DNA được tách chiết.
Nồng độ DNA
Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260nm (OD260nm - Optical Density 260nm)
của các mẫu đo cho phép xác định nồng độ DNA trong mẫu dựa vào tương quan :
Một đơn vị OD260nm tương ứng với một nồng độ là: 50µg/ml cho một dung
dịch sợi đôi.
Nồng độ tương đối của DNA được tính theo công thức :
C = OD260nm × d0 × So (1)
C : Nồng độ tương đối của DNA
d0 : Độ pha loãng
S0 : Hằng số, S0 = 50
Độ sạch của DNA
Để kiểm tra độ sạch của DNA trong dung dịch, cần đo thêm OD ở 280nm đây là bước sóng các protein có mức hấp thụ cao nhất, nhưng các protein cũng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 260nm như các DNA và do đó làm sai lệch giá trị thật của
nồng độ DNA. Tiếp theo tính tỷ số OD260nm/OD280nm (2), DNA được xem là sạch khi
Nguyễn Thị Lan 46
Các bƣớc tiến hành:
Pha loãng DNA 200 lần.
Lấy 1ml nước khử vô trùng làm đối chứng.
Đo lần lượt các mẫu DNA đã pha loãng ở các bước sóng 260nm và 280nm. Sau đó, tính nồng độ và độ sạch của DNA theo (1) và (2).
Phương pháp định lượng bằng quang phổ kế cho phép ước lượng tương đối nồng độ DNA có trong mẫu.
2.2.3. Điện di trên gel Agarose
Nguyên tắc điện di
Điện di là kỹ thuật được sử dụng trong thí nghiệm để phân tích các đại phân tử tích điện. Trong phòng thí nghiệm sinh học phân tử người ta thường sử dụng