nhiệt độ và độ ẩm cao
Trước tiên, chúng tôi đã dùng mồi P5 nhân với DNA của 10 mẫu giống tằm trong đó 5 mẫu giống tằm đa hệ (THT, ĐSK, TM, HLS, DMS) là những giống có
khả năng chịu nóng ẩm cao và 5 mẫu giống tằm lưỡng hệ (01, 02, A1, A2, BV12) là
những giống không có khả năng này. Kết quả nhận được một phân đoạn kích thước khoảng 1500bp và giống như kết quả nghiên cứu đa hình trên, phân đoạn này chỉ khuếch đại trên các giống tằm đa hệ - giếng 1 đến giếng 5, còn các giếng 6 đến 10 là các giống tằm lưỡng hệ, phân đoạn này không xuất hiện (hình 14).
T
Từừkkếếtt qquuảảttrrêênn xxááccđđịịnnh phân đoạn 1500bp có khả năng liên quan đến khả h
năng chịu nhiệt độ và độ ẩm cao. Chúng tôi tiến hành dòng hóa phân đoạn này với mục đích sử dụng chúng làm marker phân tử để đánh giá chỉ tiêu trên. Đầu tiên,
Hình 14. Ảnh điện di sản phẩm PCR
M: Marker 1kb của Fermentas
Nguyễn Thị Lan 63
chúng tôi tiến hành thôi gel phân đoạn đặc trưng trên bằng kit bộ kit thôi gel của Fermentas, tách riêng phân đoạn và sau đó gắn vào vector pJET 1.2.
Sản phẩm ligation được biến nạp vào E.coli DH5α, mẫu được cấy trải trên
đĩa petri có chứa môi trường LB đặc và nuôi trong tủ ấm 370C qua đêm. Kết quả
quan sát thấy có các khuẩn lạc màu trắng xuất hiện trên đĩa thạch (Hình 15). Những khuẩn lạc to, tròn, màu trắng đục, không có khuẩn lạc vệ tinh xung quanh là những khuẩn lạc có khả năng mang gen chờ đợi.
Từ kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E.coli DH5 α, tiến hành chọn lọc 10 khuẩn lạc to, tròn nhất, màu trắng đục và không có các khuẩn lạc vệ tinh xung quanh. Các khuẩn lạc được nuôi lắc và được sử dụng để tách chiết plasmid. Ly tâm thu sinh khối và tiến hành điện di kiểm tra sản phẩm plasmid trên gel agarose 1%. Kết quả điện di được trình bày ở hình 16:
Hình 16. Ảnh điện di sản phẩm tách chiết DNA plasmid
1 - 10: DNA plasmid của các dòng 11: Vector pJET 1.2
Nguyễn Thị Lan 64
Hình 16 cho thấy, trong 10 giếng điện di bao gồm có cả các plasmid di chuyển nhanh (có trọng lượng phân tử nhỏ) và các plasmid di chuyển chậm (có trọng lượng phân tử lớn). Ở giếng 2, 3, 5, 8, 10 các plasmid di chuyển nhanh, có kích thước trùng với kích thước của vector, nghĩa là khả năng không gắn đoạn gen mục tiêu 1500bp. Còn các plasmid ở giếng 1, 4, 6, 7, 9 di chuyển chậm hơn trên bản điện di tức là có trọng lượng phân tử lớn nên khả năng đã được gắn đoạn gen 1500bp liên quan đến khả năng chống chịu. Những plasmid này được lựa chọn để kiểm tra bằng enzyme cắt giới hạn, nhằm khẳng định plasmid được chọn đã được gắn đoạn gen mục tiêu 1500bp.
Để kiểm tra chắc chắn plasmid được chọn mang đúng đoạn gen mong muốn,
tiến hành cắt những plasmid này bằng enzym XbaI và XhoI. Sản phẩm cắt sau đó
được điện di kiểm tra trên gel agarose 1%. Kết quả được trình bày trong hình 17.
Hình 17 cho thấy, ở tất cả các giếng từ 1 đến 5, XbaI và XhoI đều cắt plasmid
thành 2 băng rõ rệt. Ở các giếng 1, 3, 4, 5, enzyme XbaI và XhoI cắt DNA plasmid
thành 2 vạch băng rõ ràng có kích thước lần lượt là 1500bp và 2974bp. Kích thước 2974bp là kích thước của vector pJET 1.2, còn vạch băng 1500bp tương ứng với đoạn gen liên quan tới khả năng chống chịu. Có thể kết luận là DNA plasmid của các giếng 1, 3, 4, 5 đã được gắn vào vector pJET 1.2.
Nguyễn Thị Lan 65
Ở giếng số 2, enzyme XbaI và XhoI cũng cắt DNA plasmid thành 2 vạch
băng. Một vạch băng có kích thước là 2974bp là kích thước của vector pJET 1.2, một vạch băng còn lại có kích thước nhỏ hơn 1500bp ( khoảng 1000bp). Có thể giải thích điều này là do trong quá trình tiến hành, DNA mục tiêu có thể bị đứt gãy. Do vậy mà vạch băng thu được không có kích thước là 1500bp như lý thuyết.
Trước khi tiến hành giải trình tự, plasmid phải được tinh sạch. Từ kết quả kiểm tra kết quả biến nạp bằng enzyme cắt giới hạn, tiến hành chọn plasmid tương ứng với giếng số 4 để tiến hành tinh sạch. Kết quả được trình bày trong hình 18:
Kết quả hình 18 cho thấy băng điện di rõ ràng và không có các băng phụ. Điều đó chứng tỏ plasmid đã được tinh sạch, đạt yêu cầu cho việc giải trình tự và kích thước của phân đoạn khoảng 1500bp.