Trước khi tiến hành đọc trình tự, plasmid phải được tinh sạch. Các bước tiến hành tinh sạch gồm:
Hút 40 µl sản phẩm plasmid và 460 µl nước khử ion rồi cho vào ống
eppendorf 1,5ml.
Bổ sung thêm 500 µl cloroform, đảo đều
Ly tâm sản phẩm ở 12000 vòng/phút trong 15 phút.
Sản phẩm sau khi ly tâm phân thành 3 lớp: lớp trên cùng là DNA, lớp giữa là protein và lớp dưới cùng là cloroform. Tiến hành hút dịch DNA và bổ sung vào ống
eppendorf 1,5ml mới có chứa 40 µl CH3COONa và 1ml ethanol 100%.
Tủa ở nhiệt độ -200C trong 2 giờ.
Lấy sản phẩm sau khi tủa đem ly tâm với tốc độ 12000 vòng/phút trong 20 phút.
Đổ dịch và thu sản phẩm plasmid.
Bổ sung 400µl cồn 70%, ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút.
Bổ sung tiếp 300 µl cồn 70%, ly tâm 12000 vòng/phút trong vòng 10 phút Làm khô.
Hòa tan plasmid sau khi đã tinh sạch bằng 25 µl nước khử ion. Điện di 3 µl sản phẩm plasmid + 1,5 µl loading dye.
2.2.13. Phƣơng pháp xác định trình tự gen
Sản phẩm plasmid mang gen mong muốn sau khi tinh sạch đem đọc trình tự trên máy tự động ABI PRISM 3100- Avant Data Collection v1.0 của Mỹ với cặp mồi M13F và M13R được thiết kế cho vector tách dòng, sau đó được phân tích bằng phần mềm CLUSTALX (1.81) và so sánh với trình tự gen trong ngân hàng gen bằng chương trình BLAST.
Nguyễn Thị Lan 54
2.2.14. Phƣơng pháp thiết kế mồi
Dựa vào trình tự DNA của phân đoạn đặc hiệu có khả năng liên quan khả năng chống chịu nhiệt độ và độ ẩm cao. Dùng phần mềm primer 3 để thiết kế cặp mồi đặc hiệu.
Nguyễn Thị Lan 55
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân tích đa hình phân tử
3.1.1. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số
Sau khi tách chiết và tinh sạch DNA tổng số của các giống tằm như đã trình bày trong phương pháp nghiên cứu, chúng tôi tiến hành kiểm tra độ tinh sạch bằng phương pháp điện di và đo quang phổ kế. Kết quả được trình bày trong hình 6 và bảng 9.
Hình 6 cho thấy, DNA tổng số sau khi tách chiết cho các băng gọn đẹp, không bị đứt gãy, tập trung thành một phân đoạn có kích thước khoảng 21,6kb. Mẫu thu được đã sạch RNA và tiếp tục được kiểm tra độ sạch bằng đo quang phổ, kết quả được trình bày trong bảng 10.
Hình 6. Kết quả điện di DNA tổng số của các giống tằm
M: Marker Lambda DNA /EcoRI + HindIII 1-10: Các mẫu giống tằm
21,6kb
Nguyễn Thị Lan 56
Bảng 10. Nồng độ và độ sạch DNA của các mẫu nghiên cứu
STT Tên mẫu Độ sạch DNA (OD260 /OD280) Nồng độ DNA (µg/µl) STT Tên mẫu Độ sạch DNA (OD260 /OD280) Nồng độ DNA (µg/µl) 1 S1 1,91 2,80 21 G3 1,96 2,50 2 S2 1,85 2,75 22 G4 1,87 2,40 3 S3 1,86 2,80 23 M1 1,92 2,20 4 S4 1,89 2,58 24 M2 1,98 2,70 5 S5 1,95 2,68 25 M4 1,86 2,40 6 S6 1,98 2,80 26 M5 1,96 2,35 7 S7 1,89 2,19 27 V5 1,82 2,40 8 S8 1,85 2,52 28 V7 1,98 2,20 9 S9 1,88 2,48 29 V9 1,86 2,50 10 S10 1,86 2,30 30 V11 1,84 2,70 11 I 2,00 2,90 31 THT 1,80 2,8 12 II 1,92 2,50 32 ĐSK 1,83 2,58 13 III 1,86 2,80 33 TM 1,82 2,48 14 IV 1,97 2,54 34 HLS 2,02 2,39 15 C1 1,85 2,56 35 DMS 1,82 2,90 16 C3 1,94 2,50 36 O1 1,81 2,80 17 C5 1,86 2,90 37 O2 1,96 2,7 18 C7 1,84 2,50 38 A1 1,82 2,43 19 G1 1,88 2,20 39 A2 1,94 2,27 20 G2 1,85 2, 39 40 BV12 1,96 2,56
Bảng 9 cho thấy các mẫu DNA có giá trị OD260nm/OD280nm dao động trong
khoảng 1,80 (với mẫu THT) đến 2,02 (với mẫu HLS ). Khoảng dao động này nằm trong giới hạn cho phép về yêu cầu của độ tinh sạch (1,8 – 2,0). Bên cạnh đó, nồng độ DNA nằm trong khoảng 2,19 (µg/µl) tới 2,9 (µg/µl) nên có thể pha loãng trong dung dịch theo nồng độ mong muốn.
Nguyễn Thị Lan 57
3.1.2. Phân tích đa hình phân tử của các giống tằm
Dùng 15 mồi ISSR để phân tích DNA của 30 giống tằm, số liệu được trình bày ở bảng 11, trong đó hai mồi P6 và L11 không khuếch đại được phân đoạn nào, các mồi còn lại đều cho sản phẩm PCR. Chúng tôi đã thu được tổng số 2216 phân đoạn, trung bình 170,46 phân đoạn cho mỗi mồi, trong đó có 1766 phân đoạn đa hình, trung bình 135,85 phân đoạn trên mồi, tỷ lệ đa hình chiếm 79,69%. Hệ số PIC cao nhất đạt 0,8823 ở mồi P1, thấp nhất 0,3132 ở mồi P11, trung bình đạt 0,727. Tỷ lệ đa hình và hệ số PIC cho thấy nguồn gen phân tích có đa dạng cao.
Bảng 11. Số phân đoạn, tỷ lệ đa hình và hệ số PIC
TT Mồi Số PĐ đƣợc khuếch đại Số PĐ đa hình TLĐH (%) PIC
1 P1 156 156 100 0,8823 2 P2 47 47 100 0,7122 3 P3 120 90 75 0,7711 4 P4 150 120 80 0,8096 5 P5 10 0 0 0 6 P6 0 0 0 0 7 P7 254 254 100 0,8445 8 P8 214 184 85,98 0,7068 9 P9 246 246 100 0,7744 10 P10 201 171 85,07 0,5794 11 P11 269 59 21,93 0,3132 12 P12 216 156 72,22 0,6490 13 T1 123 93 75,61 0,8421 14 L11 0 0 0 0 15 L13 210 180 85,71 0,7277 Tổng số 2216 1766 79,69 0,7177
Nguyễn Thị Lan 58
Số lượng các phân đoạn DNA được nhân bản với các mồi đa hình dao động từ 47 ở mồi P2 đến 269 ở mồi P11, số phân đoạn đa hình khuếch đại nhiều nhất là 269 ở mồi P11 và ít nhất là 47 ở mồi P2, mồi P5 chỉ cho 1 phân đoạn và chỉ khuếch đại ở 10 giống tằm đa hệ (hình 7). Mồi P1, P2, P7, P9 tỷ lệ đa hình cao nhất đạt 100% (hình 9). Mồi P11 có tỷ lệ đa hình thấp nhất là 21,93% (hình 10) Tỷ lệ đa hình không tỷ lệ thuận với số phân đoạn được nhân.
Hình 7. Ảnh điện di sản phẩm PCR
1-10: Các giống đa hệ S1-S10 với mồi P5 M: Marker 1kb của Fermentas M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1500bp
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M 11121314 15 16 17 18 19 20
Hình 8. Ảnh điện di sản phẩm PCR
1-10: Các giống đa hệ S1-S10 với mồi P4 11-20: Giống đa hệ S1-S10 với mồi P3
M: Marker 1kb của Fermentas
Hình 9. Ảnh điện di sản phẩm PCR
1- 20: Các giống lưỡng hệ với mồi P1 M: Marker 1kb của Fermentas
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10M11121314 1516 17181920
Hình 10. Ảnh điện di sản phẩm PCR
1- 20: Các giống lưỡng hệ với mồi P11 M: Marker 1kb của Fermentas
Nguyễn Thị Lan 59
3.1.3. Phân tích quan hệ di truyền giữa các giống tằm
Từ các kết quả thu được, hệ số tương đồng di truyền (HSTĐDT) giữa các giống tằm nghiên cứu được xác định bằng sử dụng phần mềm NTSYS_PC version 2.02 và được trình bày ở bảng 12. Hệ số này có giá trị càng cao, mối tương quan di truyền giữa các giống càng lớn và ngược lại.
Kết quả bảng 12 cho thấy HSTĐDT giữa các giống dao động từ 0,55 đến 0,95. Có 73/431 cặp giống có hệ số tương đồng di truyền trong khoảng 0,5 chiếm 16,89%; 184 cặp giống có giá trị này trong khoảng 0,6 chiếm 42,69%; trong khoảng 0,7 có 97 cặp chiếm 22,51%; trong khoảng 0,8 có 55 cặp chiếm 12,76%; trong
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M 11121314151617181920
Hình 11. Ảnh điện di sản phẩm PCR
1- 20: Các giống lưỡng hệ kén trắng với mồi P8 M: Marker 1kb của Fermentas
Hình 12. Ảnh điện di sản phẩm PCR
1- 20: Các giống lưỡng hệ kén trắng với mồi P9 M: Marker 1kb của Fermentas
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M 1112131415161718 19 20
Nguyễn Thị Lan 60
khoảng 0,9 có 22 cặp chiếm 5,10%. Quan sát giữa các giống tằm thuộc hệ kén Nhật Bản chúng tôi thấy hệ số tương đồng di truyền trong khoảng 0,6 có 21/45 cặp chiếm 46,67%; trong khoảng 0,7 có 20 cặp giống tương đương 44,44% và trong khoảng 0,8 có 4 cặp giống chiếm 8,89%. Còn các giống tằm thuộc hệ kén Trung Quốc có 17/45 cặp giống với hệ số tương đồng di truyền trong khoảng 0,7 chiếm 37,78% và trong khoảng 0,8 có 28 cặp chiếm 62,22%. Các giống tằm đa hệ địa phương có quan hệ di truyền rất gần gũi, trong khoảng 0,8 có 24/45 cặp chiếm 53,33% và trong khoảng 0,9 có 21 cặp đạt 46,66%. Giữa các giống tằm thuộc hệ kén Trung Quốc và hệ kén Nhật Bản có 40/100 cặp giống với hệ số tương đồng di truyền trong khoảng 0,6 chiếm 40,0% trong khoảng 0,7 có 60 cặp chiếm 60,0%. Giữa các giống hệ Nhật Bản và giống địa phương có có 45,0% cặp với hệ số hệ số tương đồng trong khoảng 0,5 và 55,0% trong khoảng 0,6 còn giữa các giống hệ Trung Quốc với giống địa phương có 28% cặp với hệ số tương đồng trong khoảng 0,5 và 72,0% trong khoảng 0,6. Hệ số tương quan r = 0,952 thể hiện quan hệ tuyến tính chặt của các số liệu phân tích. Theo một số công bố trên đối tượng cây trồng, khi hệ số tương đồng giữa các cặp giống lớn hơn 0,7 thường cho ưu thế lai thấp hoặc không cho ưu thế lai, còn với những cặp giống có chỉ số này càng nhỏ càng cho ưu thế lai cao. Trên tằm dâu, chưa có tài liệu nào đề cập tới vấn đề trên. Theo những nghiên cứu của chúng tôi trên những giống tằm đang lưu hành trong sản xuất, các giống tạo cặp lai cấpI F1 nhị nguyên để sản xuất cặp lai tứ nguyên thường cùng hệ kén và có hệ số tương đồng trong khoảng 0,7-0,8 còn cặp lai nhị nguyên thì khác hệ kén và có hệ số tương đồng trong khoảng 0,6-0,7 [48].
3.1.4. Xây dựng sơ đồ quan hệ di truyền giữa các giống tằm
Với các số liệu nhận được, chúng tôi đã thiết lập sơ đồ hình cây về quan hệ di truyền giữa các giống tằm nghiên cứu. Kết quả được biểu diễn trên hình 13.
Nguyễn Thị Lan 61
Sơ đồ quan hệ di truyền giữa các giống tằm cho thấy, 30 giống tằm được chia làm 2 nhóm theo năng suất chất lượng tơ kén cũng như khả năng chịu nóng ẩm cao. Nhóm I bao gồm 20 giống lưỡng hệ, phân thành 2 phân nhóm chính, phân nhóm chính I.1 có 3 giống V5, G2 và G4, được chia thành 2 phân nhóm phụ, phân nhóm phụ I.1.1 chỉ có giống V5, phân nhóm phụ I.1.2 bao gồm giống G2 và G4. Phân nhóm chính 2 gồm toàn bộ 17 giống lưỡng hệ còn lại và chia thành 2 phân nhóm phụ. Phân nhóm phụ I.2.1 gồm bốn giống II, III, M1, C5 chia thành các phân nhóm nhỏ và dưới phân nhóm khác, phân nhóm phụ I.2.2 là các giống còn lại, được chia thành các phân nhóm nhỏ và dưới phân nhóm khác. Nhóm II bao gồm 10 giống đa hệ được chia thành 2 phân nhóm. Phân nhóm II.1 là giống S3, phân nhóm II.2 là 9 giống còn lại, được chia thành các phân nhóm nhỏ hơn và dưới phân nhóm nhỏ khác.
3.2. Nghiên cứu phát triển chỉ thị phân tử liên quan đến khả năng chịu nhiệt độ và ẩm độ cao của giống và ẩm độ cao của giống
3.2.1. Xác định chỉ thị phân tử liên quan đến khả năng chịu nhiệt độ và ẩm độ cao ẩm độ cao
Kết quả nghiên cứu đa hình ISSR của các giống tằm cho thấy mồi P5 chỉ khuếch đại ở các giống đa hệ với đặc điểm năng suất chất lượng tơ kén thấp
II
Hình 13. Sơ đồ quan hệ di truyền giữa các giống tằm
I: Các giống tằm lưỡng hệ II: Các giống tằm đa hệ
Coefficient 0.61 0.70 0.79 0.88 0.97 II III M1 C5 M5 V7 M3 M4 G1 I IV G3 V9 V11 C1 C7 C3 G2 G4 V5 S1 S10 S5 S2 S4 S6 S7 S8 S9 S3 I II
Nguyễn Thị Lan 62
nhưng khả năng chịu nóng ẩm cao và cho duy nhất một phân đoạn kích thước khoảng 1500bp (hình 7), còn các giống lưỡng hệ với năng suất chất lượng tơ kén cao nhưng không có khả năng chịu nóng ẩm thì không cho sản phẩm PCR (không dẫn ảnh). Do đó đoạn DNA liên quan được lựa chọn để xác định trình tự và nghiên cứu làm marker để đánh giá chỉ tiêu trên.
3.2.2. Khuếch đại và dòng hóa phân đoạn liên quan đến khả năng chịu nhiệt độ và độ ẩm cao nhiệt độ và độ ẩm cao
Trước tiên, chúng tôi đã dùng mồi P5 nhân với DNA của 10 mẫu giống tằm trong đó 5 mẫu giống tằm đa hệ (THT, ĐSK, TM, HLS, DMS) là những giống có
khả năng chịu nóng ẩm cao và 5 mẫu giống tằm lưỡng hệ (01, 02, A1, A2, BV12) là
những giống không có khả năng này. Kết quả nhận được một phân đoạn kích thước khoảng 1500bp và giống như kết quả nghiên cứu đa hình trên, phân đoạn này chỉ khuếch đại trên các giống tằm đa hệ - giếng 1 đến giếng 5, còn các giếng 6 đến 10 là các giống tằm lưỡng hệ, phân đoạn này không xuất hiện (hình 14).
T
Từừkkếếtt qquuảảttrrêênn xxááccđđịịnnh phân đoạn 1500bp có khả năng liên quan đến khả h
năng chịu nhiệt độ và độ ẩm cao. Chúng tôi tiến hành dòng hóa phân đoạn này với mục đích sử dụng chúng làm marker phân tử để đánh giá chỉ tiêu trên. Đầu tiên,
Hình 14. Ảnh điện di sản phẩm PCR
M: Marker 1kb của Fermentas
Nguyễn Thị Lan 63
chúng tôi tiến hành thôi gel phân đoạn đặc trưng trên bằng kit bộ kit thôi gel của Fermentas, tách riêng phân đoạn và sau đó gắn vào vector pJET 1.2.
Sản phẩm ligation được biến nạp vào E.coli DH5α, mẫu được cấy trải trên
đĩa petri có chứa môi trường LB đặc và nuôi trong tủ ấm 370C qua đêm. Kết quả
quan sát thấy có các khuẩn lạc màu trắng xuất hiện trên đĩa thạch (Hình 15). Những khuẩn lạc to, tròn, màu trắng đục, không có khuẩn lạc vệ tinh xung quanh là những khuẩn lạc có khả năng mang gen chờ đợi.
Từ kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E.coli DH5 α, tiến hành chọn lọc 10 khuẩn lạc to, tròn nhất, màu trắng đục và không có các khuẩn lạc vệ tinh xung quanh. Các khuẩn lạc được nuôi lắc và được sử dụng để tách chiết plasmid. Ly tâm thu sinh khối và tiến hành điện di kiểm tra sản phẩm plasmid trên gel agarose 1%. Kết quả điện di được trình bày ở hình 16:
Hình 16. Ảnh điện di sản phẩm tách chiết DNA plasmid
1 - 10: DNA plasmid của các dòng 11: Vector pJET 1.2
Nguyễn Thị Lan 64
Hình 16 cho thấy, trong 10 giếng điện di bao gồm có cả các plasmid di chuyển nhanh (có trọng lượng phân tử nhỏ) và các plasmid di chuyển chậm (có trọng lượng phân tử lớn). Ở giếng 2, 3, 5, 8, 10 các plasmid di chuyển nhanh, có kích thước trùng với kích thước của vector, nghĩa là khả năng không gắn đoạn gen mục tiêu 1500bp. Còn các plasmid ở giếng 1, 4, 6, 7, 9 di chuyển chậm hơn trên bản điện di tức là có trọng lượng phân tử lớn nên khả năng đã được gắn đoạn gen 1500bp liên quan đến khả năng chống chịu. Những plasmid này được lựa chọn để kiểm tra bằng enzyme cắt giới hạn, nhằm khẳng định plasmid được chọn đã được gắn đoạn gen mục tiêu 1500bp.
Để kiểm tra chắc chắn plasmid được chọn mang đúng đoạn gen mong muốn,
tiến hành cắt những plasmid này bằng enzym XbaI và XhoI. Sản phẩm cắt sau đó
được điện di kiểm tra trên gel agarose 1%. Kết quả được trình bày trong hình 17.
Hình 17 cho thấy, ở tất cả các giếng từ 1 đến 5, XbaI và XhoI đều cắt plasmid
thành 2 băng rõ rệt. Ở các giếng 1, 3, 4, 5, enzyme XbaI và XhoI cắt DNA plasmid
thành 2 vạch băng rõ ràng có kích thước lần lượt là 1500bp và 2974bp. Kích thước 2974bp là kích thước của vector pJET 1.2, còn vạch băng 1500bp tương ứng với đoạn gen liên quan tới khả năng chống chịu. Có thể kết luận là DNA plasmid của các giếng 1, 3, 4, 5 đã được gắn vào vector pJET 1.2.
Nguyễn Thị Lan 65