CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân tích đa hình phân tử
3.1.1. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số
Sau khi tách chiết và tinh sạch DNA tổng số của các giống tằm như đã trình bày trong phương pháp nghiên cứu, chúng tôi tiến hành kiểm tra độ tinh sạch bằng phương pháp điện di và đo quang phổ kế. Kết quả được trình bày trong hình 6 và bảng 9.
Hình 6 cho thấy, DNA tổng số sau khi tách chiết cho các băng gọn đẹp, không bị đứt gãy, tập trung thành một phân đoạn có kích thước khoảng 21,6kb. Mẫu thu được đã sạch RNA và tiếp tục được kiểm tra độ sạch bằng đo quang phổ, kết quả được trình bày trong bảng 10.
Hình 6. Kết quả điện di DNA tổng số của các giống tằm M: Marker Lambda DNA /EcoRI + HindIII
1-10: Các mẫu giống tằm 21,6kb
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Nguyễn Thị Lan 56
Bảng 10. Nồng độ và độ sạch DNA của các mẫu nghiên cứu
STT Tên mẫu
Độ sạch DNA (OD260 /OD280)
Nồng độ DNA (àg/àl)
STT Tên mẫu
Độ sạch DNA (OD260 /OD280)
Nồng độ DNA (àg/àl)
1 S1 1,91 2,80 21 G3 1,96 2,50
2 S2 1,85 2,75 22 G4 1,87 2,40
3 S3 1,86 2,80 23 M1 1,92 2,20
4 S4 1,89 2,58 24 M2 1,98 2,70
5 S5 1,95 2,68 25 M4 1,86 2,40
6 S6 1,98 2,80 26 M5 1,96 2,35
7 S7 1,89 2,19 27 V5 1,82 2,40
8 S8 1,85 2,52 28 V7 1,98 2,20
9 S9 1,88 2,48 29 V9 1,86 2,50
10 S10 1,86 2,30 30 V11 1,84 2,70
11 I 2,00 2,90 31 THT 1,80 2,8
12 II 1,92 2,50 32 ĐSK 1,83 2,58
13 III 1,86 2,80 33 TM 1,82 2,48
14 IV 1,97 2,54 34 HLS 2,02 2,39
15 C1 1,85 2,56 35 DMS 1,82 2,90
16 C3 1,94 2,50 36 O1 1,81 2,80
17 C5 1,86 2,90 37 O2 1,96 2,7
18 C7 1,84 2,50 38 A1 1,82 2,43
19 G1 1,88 2,20 39 A2 1,94 2,27
20 G2 1,85 2, 39 40 BV12 1,96 2,56
Bảng 9 cho thấy các mẫu DNA có giá trị OD260nm/OD280nm dao động trong khoảng 1,80 (với mẫu THT) đến 2,02 (với mẫu HLS ). Khoảng dao động này nằm trong giới hạn cho phép về yêu cầu của độ tinh sạch (1,8 – 2,0). Bên cạnh đó, nồng độ DNA nằm trong khoảng 2,19 (àg/àl) tới 2,9 (àg/àl) nờn cú thể pha loóng trong dung dịch theo nồng độ mong muốn.
Nguyễn Thị Lan 57
3.1.2. Phân tích đa hình phân tử của các giống tằm
Dùng 15 mồi ISSR để phân tích DNA của 30 giống tằm, số liệu được trình bày ở bảng 11, trong đó hai mồi P6 và L11 không khuếch đại được phân đoạn nào, các mồi còn lại đều cho sản phẩm PCR. Chúng tôi đã thu được tổng số 2216 phân đoạn, trung bình 170,46 phân đoạn cho mỗi mồi, trong đó có 1766 phân đoạn đa hình, trung bình 135,85 phân đoạn trên mồi, tỷ lệ đa hình chiếm 79,69%. Hệ số PIC cao nhất đạt 0,8823 ở mồi P1, thấp nhất 0,3132 ở mồi P11, trung bình đạt 0,727. Tỷ lệ đa hình và hệ số PIC cho thấy nguồn gen phân tích có đa dạng cao.
Bảng 11. Số phân đoạn, tỷ lệ đa hình và hệ số PIC
TT Mồi Số PĐ đƣợc khuếch đại Số PĐ đa hình TLĐH (%) PIC
1 P1 156 156 100 0,8823
2 P2 47 47 100 0,7122
3 P3 120 90 75 0,7711
4 P4 150 120 80 0,8096
5 P5 10 0 0 0
6 P6 0 0 0 0
7 P7 254 254 100 0,8445
8 P8 214 184 85,98 0,7068
9 P9 246 246 100 0,7744
10 P10 201 171 85,07 0,5794
11 P11 269 59 21,93 0,3132
12 P12 216 156 72,22 0,6490
13 T1 123 93 75,61 0,8421
14 L11 0 0 0 0
15 L13 210 180 85,71 0,7277
Tổng số 2216 1766 79,69 0,7177
Nguyễn Thị Lan 58
Số lượng các phân đoạn DNA được nhân bản với các mồi đa hình dao động từ 47 ở mồi P2 đến 269 ở mồi P11, số phân đoạn đa hình khuếch đại nhiều nhất là 269 ở mồi P11 và ít nhất là 47 ở mồi P2, mồi P5 chỉ cho 1 phân đoạn và chỉ khuếch đại ở 10 giống tằm đa hệ (hình 7). Mồi P1, P2, P7, P9 tỷ lệ đa hình cao nhất đạt 100% (hình 9). Mồi P11 có tỷ lệ đa hình thấp nhất là 21,93% (hình 10) Tỷ lệ đa hình không tỷ lệ thuận với số phân đoạn được nhân.
Hình 7. Ảnh điện di sản phẩm PCR 1-10: Các giống đa hệ S1-S10 với mồi P5
M: Marker 1kb của Fermentas M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1500bp
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M 11121314 15 16 17 18 19 20
Hình 8. Ảnh điện di sản phẩm PCR 1-10: Các giống đa hệ S1-S10 với mồi P4
11-20: Giống đa hệ S1-S10 với mồi P3 M: Marker 1kb của Fermentas
Hình 9. Ảnh điện di sản phẩm PCR 1- 20: Các giống lưỡng hệ với mồi P1
M: Marker 1kb của Fermentas
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10M11121314 1516 17181920
Hình 10. Ảnh điện di sản phẩm PCR 1- 20: Các giống lưỡng hệ với mồi P11
M: Marker 1kb của Fermentas
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M 11121314151617 181920
Nguyễn Thị Lan 59
3.1.3. Phân tích quan hệ di truyền giữa các giống tằm
Từ các kết quả thu được, hệ số tương đồng di truyền (HSTĐDT) giữa các giống tằm nghiên cứu được xác định bằng sử dụng phần mềm NTSYS_PC version 2.02 và được trình bày ở bảng 12. Hệ số này có giá trị càng cao, mối tương quan di truyền giữa các giống càng lớn và ngược lại.
Kết quả bảng 12 cho thấy HSTĐDT giữa các giống dao động từ 0,55 đến 0,95. Có 73/431 cặp giống có hệ số tương đồng di truyền trong khoảng 0,5 chiếm 16,89%; 184 cặp giống có giá trị này trong khoảng 0,6 chiếm 42,69%; trong khoảng 0,7 có 97 cặp chiếm 22,51%; trong khoảng 0,8 có 55 cặp chiếm 12,76%; trong
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M 11121314151617181920
Hình 11. Ảnh điện di sản phẩm PCR 1- 20: Các giống lưỡng hệ kén trắng với mồi P8
M: Marker 1kb của Fermentas
Hình 12. Ảnh điện di sản phẩm PCR 1- 20: Các giống lưỡng hệ kén trắng với mồi P9
M: Marker 1kb của Fermentas
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M 1112131415161718 19 20
Bảng 12. Hệ số tương đồng di truyền giữa các giống tằm
Nguyễn Thị Lan 60
khoảng 0,9 có 22 cặp chiếm 5,10%. Quan sát giữa các giống tằm thuộc hệ kén Nhật Bản chúng tôi thấy hệ số tương đồng di truyền trong khoảng 0,6 có 21/45 cặp chiếm 46,67%; trong khoảng 0,7 có 20 cặp giống tương đương 44,44% và trong khoảng 0,8 có 4 cặp giống chiếm 8,89%. Còn các giống tằm thuộc hệ kén Trung Quốc có 17/45 cặp giống với hệ số tương đồng di truyền trong khoảng 0,7 chiếm 37,78% và trong khoảng 0,8 có 28 cặp chiếm 62,22%. Các giống tằm đa hệ địa phương có quan hệ di truyền rất gần gũi, trong khoảng 0,8 có 24/45 cặp chiếm 53,33% và trong khoảng 0,9 có 21 cặp đạt 46,66%. Giữa các giống tằm thuộc hệ kén Trung Quốc và hệ kén Nhật Bản có 40/100 cặp giống với hệ số tương đồng di truyền trong khoảng 0,6 chiếm 40,0% trong khoảng 0,7 có 60 cặp chiếm 60,0%. Giữa các giống hệ Nhật Bản và giống địa phương có có 45,0% cặp với hệ số hệ số tương đồng trong khoảng 0,5 và 55,0% trong khoảng 0,6 còn giữa các giống hệ Trung Quốc với giống địa phương có 28% cặp với hệ số tương đồng trong khoảng 0,5 và 72,0% trong khoảng 0,6. Hệ số tương quan r = 0,952 thể hiện quan hệ tuyến tính chặt của các số liệu phân tích. Theo một số công bố trên đối tượng cây trồng, khi hệ số tương đồng giữa các cặp giống lớn hơn 0,7 thường cho ưu thế lai thấp hoặc không cho ưu thế lai, còn với những cặp giống có chỉ số này càng nhỏ càng cho ưu thế lai cao. Trên tằm dâu, chưa có tài liệu nào đề cập tới vấn đề trên. Theo những nghiên cứu của chúng tôi trên những giống tằm đang lưu hành trong sản xuất, các giống tạo cặp lai cấpI F1 nhị nguyên để sản xuất cặp lai tứ nguyên thường cùng hệ kén và có hệ số tương đồng trong khoảng 0,7-0,8 còn cặp lai nhị nguyên thì khác hệ kén và có hệ số tương đồng trong khoảng 0,6-0,7 [48].
3.1.4. Xây dựng sơ đồ quan hệ di truyền giữa các giống tằm Với các số liệu nhận được, chúng tôi đã thiết lập sơ đồ hình cây về quan hệ di
truyền giữa các giống tằm nghiên cứu. Kết quả được biểu diễn trên hình 13.
Nguyễn Thị Lan 61
Sơ đồ quan hệ di truyền giữa các giống tằm cho thấy, 30 giống tằm được chia làm 2 nhóm theo năng suất chất lượng tơ kén cũng như khả năng chịu nóng ẩm cao. Nhóm I bao gồm 20 giống lưỡng hệ, phân thành 2 phân nhóm chính, phân nhóm chính I.1 có 3 giống V5, G2 và G4, được chia thành 2 phân nhóm phụ, phân nhóm phụ I.1.1 chỉ có giống V5, phân nhóm phụ I.1.2 bao gồm giống G2 và G4.
Phân nhóm chính 2 gồm toàn bộ 17 giống lưỡng hệ còn lại và chia thành 2 phân nhóm phụ. Phân nhóm phụ I.2.1 gồm bốn giống II, III, M1, C5 chia thành các phân nhóm nhỏ và dưới phân nhóm khác, phân nhóm phụ I.2.2 là các giống còn lại, được chia thành các phân nhóm nhỏ và dưới phân nhóm khác. Nhóm II bao gồm 10 giống đa hệ được chia thành 2 phân nhóm. Phân nhóm II.1 là giống S3, phân nhóm II.2 là 9 giống còn lại, được chia thành các phân nhóm nhỏ hơn và dưới phân nhóm nhỏ khác.
3.2. Nghiên cứu phát triển chỉ thị phân tử liên quan đến khả năng chịu nhiệt độ