So sánh trên ngân hàng gen
Phân đoạn gen liên quan đến khả năng chống chịu nhiệt độ và ẩm độ cao của giống tằm được dùng làm chuỗi truy cập trong chương trình BLAST để tìm kiếm các chuỗi đích đã được đăng ký trên ngân hàng gen dựa vào mức độ tương đồng về nucleotide. Kết quả cho thấy một phần trình tự đoạn gen nghiên cứu có độ tương đồng với 3 trình tự mã số được đăng ký trên ngân hàng gen: Mã số dbj|AP009031.1|
Nguyễn Thị Lan 67
với mức tương đồng là 95%, mã số gb|DQ243612.1| với mức tương đồng là 95% và dbj|AP009027.1| với mức tương đồng thấp nhất là 90%.
Với mã số dbj|AP009031.1|:
Mức độ tương đồng của đoạn gen liên quan tới khả năng chống chịu của tằm dâu (1500bp) và mã số dbj|AP009031.1| trên ngân hàng gen là 95% (81/85 nucleotide tương đồng). Mã số dbj|AP009031.1| nằm trên nhiễm sắc thể số 2 của
Nguyễn Thị Lan 68
trình tự genome tằm dâu, mã số locus là AP009031 và có chiều dài là 110.996 bp. Sự tương đồng giữa trình tự đoạn gen (1500bp) và mã số dbj|AP009031.1| thể hiện ở đoạn nucleotide từ 11 tới 95 (với trình tự đoạn gen) tương ứng với đoạn nucleotide 46.675 đến 46.592 (với mã số dbj|AP009031.1|). Ở trình tự nucleotide của mã số dbj|AP009031.1|, nucleotide số 46.653 là A được thay thế là C ở vị trí số 33 với trình tự đoạn 1500bp. Tương tự nucleotide số 46.610 là G được thay thế là T ở vị trí nucletide số 76, 46.608 là T được thay thế là C ở vị trí số 78. Tuy nhiên, ở vị trí nucletide số 92 của đoạn 1500bp là C trong khi ở vị trí tương ứng của dbj|AP009031.1| là 46.595 lại không xuất hiện nucleotide nào.
Với mã số gb|DQ243612.1|:
Mức độ tương đồng của đoạn gen liên quan tới khả năng chống chịu của tằm dâu (1500bp) với mã số gb|DQ243612.1| trên ngân hàng gen đạt 95% (81/85 nucleotide tương đồng) giống mức tương đồng của trình tự đoạn gen liên quan tới khả năng chống chịu với mã số dbj|AP009031.1| cả về sự thay thế số nucleotide của đoạn gen ở vị trí số 33, 76, 78, 92. Mã số gb|DQ243612.1| có kích thước là 746bp và số locus là DQ243612. Sự tương đồng giữa trình tự đoạn gen (1500bp) và mã số gb|DQ243612.1| thể hiện ở đoạn nucleotide từ 11 tới 95 (với trình tự đoạn gen) tương ứng với đoạn nucleotide 134 đến 51 (với mã số gb|DQ243612.1|). Sự sai khác của các nucleotit ở vị trí số 33, 76, 78, 92 của phân đoạn 1550bp tương ứng với vị trí số 112, 70, 68, 54 của mã số gb|DQ243612.1|.
Nguyễn Thị Lan 69
Với mã số dbj|AP009027.1|:
Mức độ tương đồng của đoạn gen liên quan tới khả năng chống chịu của tằm dâu (1550bp) và mã số dbj|AP009027.1| trên ngân hàng gen là 90% (81/90 nucleotide tương đồng). Mã số dbj|AP009027.1| nằm trên nhiễm sắc thể số 17 của bộ genome tằm, mã số locus là AP009027 và kích thước là 157.022 bp. Sự tương đồng của trình tự đoạn gen và mã số dbj|AP009027.1| được thể hiện ở kích thước đoạn từ nucleotide số 9 đến 97 (với trình tự đoạn gen 1550bp) tương ứng với đoạn nucleotide số 100.851 đến 100.939 (với mã số dbj|AP009027.1|). Ở trình tự nucleotide của mã số dbj|AP009027.1|, nucleotide số 100855 là T tương ứng với vị trí 13 của trình tự đoạn gen 1500bp lại không xuất hiện nucleotide. Ngược lại, ở vị trí nucleotide số 25 của trình tự đoạn gen là a trong khi vị trí tương ứng với mã số dbj|AP009027.1| là 100.867 lại không xuất hiện nucleotide. Ở vị trí nucleotide số 29 của trình tự đoạn gen là a được thay thế là T ở vị trí nucleotide số 100871 của mã số dbj|AP009027.1|. Tương tự, nucleotide số 34 là C được thay thế là G ở vị trí số 100.876, nucleotide số 37 và 38 là AA được thay thế là GG ở vị trí nucleotide số 100.879 và 100.880. Nucleotide số 75, 76 là C và T được thay thế bằng A và G ở vị trí 100.917, 100.918. Và cuối cùng là nucleotide số 78 của đoạn gen là C được thay thế bằng T của mã số dbj|AP009027.1| ở vị trí nucleotide 100.920.
Nguyễn Thị Lan 70
So sánh trên bản đồ genome tằm
So sánh trên bản đồ gen tằm, trình tự của phân đoạn 1500 phân lập nằm ở nhiễm sắc thể 18, nhiễm sắc thể này có chiều dài khoảng 15Mb và ước tính có khoảng 4611 gene, trình tự 1500 của chúng tôi nằm ở vị trí 15.602.957-15.604.458 (hình 21 và hình 22), vùng gen này chưa xác định được chức năng.
3.2.5. Thiết kế mồi, tối ƣu điều kiện khuếch đại phân đoạn liên quan đến khả năng chịu nóng ẩm cao của tằm
Dựa vào trình tự phân đoạn đặc hiệu liên quan đến khả năng chịu nhiệt độ và độ ẩm cao của tằm, với sự trợ giúp của phần mềm Primer 3, chúng tôi đã thiết kế được 4 cặp mồi được trình bày ở bảng 13:
Hình 21. Vị trí của phân đoạn 1500 trên bản đồ Genome tằm - GBrowse (chromosome)
Nguyễn Thị Lan 71
Bảng 13. Trình tự một số cặp mồi được thiết kế
Tên
mồi Trình tự 5’ – 3’ Số nu Tm
(oC)
F1 TCT TAA GAT GAC GGC TGA TAG AGG AGA ATG G 31 60.3
R1 TCG TGA CAT CAG CTT ACA ATT ACA TTT TAT
GCC G 34 60.4
F2 T GAC GGC TGA TAG AGG AGA ATG G 23 58.1
R2 TGA CAT CAG CTT ACA ATT ACA TTT TAT GCC G 31 57.8
F3 AC GGC TGA TAG AGG AGA ATG G 21 56.1
R3 AT CAG CTT ACA ATT ACA TTT TAT GCC G 27 54.4
F4 CCG GCA TCA GCT TAC AAT TAC 21 54.0
R4 GAC GGC TGA TAG AGG AGA ATG G 22 56.6
Sau khi kiểm tra, thử nghiệm, cặp mồi 4 được lựa chọn để tối ưu thành phần và chương trình chạy PCR cho phân đoạn đặc hiệu này. Chúng tôi đã thử với nhiều nồng độ của các thành phần và với các nhiệt độ bắt cặp khác nhau, sau cùng chúng tôi đã nhận được phân đoạn đặc hiệu như mong muốn với thành phần và chương trình chạy đã được tối ưu trình bày trên bảng 14 và 15.
Nguyễn Thị Lan 72
Bảng 14. Thành phần của phản ứng PCR – ISSR đặc hiệu
Thành phần Thể tích (µl)
1.Nước khử ion vô trùng 10,0
2.Bufer (10X) 2,0 3.MgCl2 (25µM) 2,0 4.dNTP (2mM) 2,0 5.Mồi F4 (2,0µM) Mồi R4 (2,0µM) 1,0 1,0
6.Taq DNA polymerase 0,2
7.DNA mẫu (20nm/µl) 1,8
Tổng thể tích phản ứng 20,0
Bảng 15. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR – ISSR đặc hiệu
Bước Chu trình Giai đoạn Nhiệt độ Thời gian
1 Biến tính ban đầu 940C 2 phút
2 Lặp lại 30
chu kỳ
Biến tính 940C 30 giây
Gắn mồi 550C 30 giây
Kéo dài mạch 720C 2 phút
Hoàn tất kéo dài mạch 720C 10 phút
Nguyễn Thị Lan 73
3.2.6. So sánh tần số khuếch đại và khảo sát mồi đặc hiệu
Sau khi tìm ra được thành phần và chương trình chạy cho mồi đặc hiệu, chúng tôi tiến hành so sánh tần số khuếch đại của phân đoạn 1500 bp liên quan đến khả năng chịu nóng ẩm cao khi sử dụng mồi đặc hiệu và mồi ISSR. Kết quả được trình bày ở bảng 16:
Bảng 16. So sánh tần số khuếch đại của phân đoạn 1500bp khi sử dụng hai loại mồi (%)
Khuếch đại đoạn DNA kích thƣớc 1500 bp
Sử dụng mồi đặc hiệu Sử dụng mồi ISSR
Tần số khuếch đại 20/20 17/20
Tỷ lệ (%) 100,0 85,0
Từ bảng 16 cho thấy, mồi đặc hiệu khuếch đại được 20/20 mẫu, đạt 100%, còn mồi ISSR 17/20 mẫu cho sản phẩm, đạt 85%. Như vậy, tần số khuếch đại đoạn DNA kích thước 1500 bp ở mồi đặc hiệu cao hơn mồi ISSR 15%. Kết quả nhận được của chúng tôi lặp lại kết quả đã công bố về chỉ thị phân tử liên quan đến năng suất chất lượng tơ kén của tằm dâu [6], [19], như vậy có thể thấy rằng mồi đặc hiệu có độ nhậy cao hơn mồi ISSR.
Sau đó, mồi đặc hiệu tiếp tục được kiểm tra đánh giá trên 3 dòng tằm có khả năng chịu nóng ẩm cao và 3 dòng không có khả năng này. Kết quả nhận được trình bày ở bảng 17. Bảng 17 cho thấy, tần số xuất hiện của phân đoạn 1500bp trên các cá thể của mỗi dòng tằm đều đạt 100% ở những dòng có khả năng chịu nóng ẩm cao, còn ở những dòng không có khả năng này thì phân đoạn 1500bp không khuếch đại.
Nguyễn Thị Lan 74
Bảng 17. Tần số suất hiện phân đoạn 1500bp trên các dòng tằm
Khả năng chịu nóng ẩm cao
Có khả năng Không có khả năng
Tần số xuất hiện của phân đoạn 1500bp trên các cá thể của mỗi dòng tằm
30/30 0
Tỷ lệ (%) 100,0 0
Với những kết quả nhận được như trên có thể thấy rằng phân đoạn 1500bp liên quan đến tính trạng về khả năng chịu nhiệt độ và ẩm độ cao của giống tằm và cặp lai. Do vậy, phân đoạn 1500bp được coi là chỉ thị phân tử liên quan đến tính trạng chống chịu này.
Tiếp theo, chỉ thị phân tử TD1500 được khảo sát trên 20 mẫu giống tằm trong đó có 5 cặp lai tam nguyên (là cặp lai có sự tham gia của giống có khả năng chịu nóng ẩm cao), kết quả trình bày trên hình 23. Hình 23 cho thấy, phân đoạn 1500bp được khuếch đại trên 100% mẫu khảo sát, đạt tỷ lệ tuyệt đối. Kết quả của chúng tôi phù hợp với số liệu của đơn vị quản lý, đánh giá giống theo phương pháp truyền thống. Do đó, chỉ thị TD1550 có thể dùng để đánh giá khả năng chịu nhiệt, ẩm độ cao của giống tằm và cặp lai.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
1500bp
Hình 23. Ảnh điện di sản phẩm PCR
M: Marker 1kb của fermentas 1-15: Mẫu giống tằm có khả năng chịu ẩm và nhiệt độ cao
Nguyễn Thị Lan 75
Chỉ thị phân tử TD1500 được tiếp tục đánh giá sự di truyền trên các thế hệ và kết quả trình bày ở hình 24.
Kết quả hình 24 cho thấy, chỉ thị phân tử TD1500 được di truyền từ thế hệ bố mẹ sang F1 tam nguyên, khi được khuếch đại ở tất cả các mẫu giống.
Như vậy với những kết quả nhận được về tần số xuất hiện cao nhất, đạt 100% của chỉ thị phân tử TD1500 và sự di truyền của chúng qua các thế hệ, có thể khảo nghiệm nhằm đưa vào sử dụng trong công tác giống, để tuyển chọn giống và cặp lai theo tính trạng chống chịu nóng ẩm cao bằng chỉ thị phân tử.
Theo phương pháp truyền thống, để đánh giá năng suất chất lượng tơ kén và khả năng chống chịu nóng ẩm cao của giống và cặp lai cần khoảng thời gian dài nuôi tằm, theo dõi các chỉ tiêu bằng phương pháp thường quy như đếm số tằm, đếm và cân số kén thu được của từng lô, của các giống bố mẹ, các cặp lai… nên bị ảnh hưởng rất lớn bởi ngoại cảnh, trong khi đó sử dụng marker phân tử chỉ cần 1 đến 2 ngày đã có thể biết được kết quả. Như vậy đánh giá giống bằng chỉ thị phân tử sẽ nhận được kết quả nhanh hơn so với phương pháp truyền thống, lại không bị ảnh hưởng bởi các yếu tố bên ngoài. Đây là những kết quả nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam theo hướng này, có thể sử dụng để tuyển chọn giống tằm có khả năng chịu nóng ẩm cao.
1500bp
Hình 24. Ảnh điện di sản phẩm PCR
M: Marker 1kb của fermentas 1-10:Mẫu giống bố 11-20: Mẫu giống mẹ
21-40: Mẫu F1 tam nguyên
21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 M 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Nguyễn Thị Lan 76
KẾT LUẬN
1. Sử dụng 15 mồi ISSR phân tích đa hình 30 giống tằm thuộc hai nhóm có khả
năng chịu nóng ẩm cao khác nhau, đã nhận được 2216 phân đoạn, trong đó có 1766 phân đoạn đa hình, tỷ lệ đa hình chiếm 79,69% thể hiện nguồn gen phân tích phong phú. Mồi P1, P2, P7, P9 có tỷ lệ đa hình cao nhất đạt 100%, mồi P5 không cho đa hình. HSTĐDT giữa các giống dao động từ 0,55 đến 0,95. Sơ đồ phân loại chia 30 giống tằm thành hai nhóm riêng biệt theo khả năng chịu nóng ẩm cao khác nhau.
2. Xác định được phân đoạn 1500bp có khả năng liên quan đến khả năng chịu
nhiệt độ và ẩm độ cao. Phân đoạn này đã được dòng hóa và xác định trình tự. Độ tương đồng của một phần phân đoạn 1500bp với các mã số dbj|AP009031.1|, gb|DQ243612.1| và dbj|AP009027.1| dao động từ 90 % đến 95% khi so sánh trên Genbank.
3. So sánh tần số khuếch đại phân đoạn khi sử dụng mồi đặc hiệu và mồi ISSR,
theo đó mồi đặc hiệu cho hiệu quả cao hơn mồi ISSR, phân đoạn 1550bp được khuếch đại với tần số 100% bằng mồi đặc hiệu và 85% bằng mồi ISSR.
4. Kiểm tra phân đoạn đặc hiệu trên 20 giống tằm nguyên liệu trong đó có 5 cặp
lai tam nguyên của Trung tâm Nghiên cứu Thực nghiệm Nông Lâm nghiệp Lâm Đồng. Phân đoạn 1500bp được khuếch đại trên 100% số mẫu giống được đánh giá bằng phương pháp truyền thống có khả năng chịu nóng ẩm cao.
5. Chỉ thị TD1500 được di truyền từ thế hệ bố mẹ đến F1 tam nguyên.
ĐỀ NGHỊ
Được tiếp tục hướng nghiên cứu này với việc thử nghiệm phân đoạn đặc hiệu của mồi thiết kế trên số lượng mẫu lớn hơn, để có thể sử dụng các phân đoạn đặc hiệu này làm marker phân tử đánh giá giống theo khả năng chịu với nhiệt độ và ẩm độ cao.
Nguyễn Thị Lan 77
TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Lê Trần Bình, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải, Trương Nam Hải, Lê Quang Huấn
(2003), Áp dụng các kỹ thuật phân tử trong nghiên cứu tài nguyên sinh vật Việt
Nam, NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.
2. Nguyễn Thị Thanh Bình, Hoàng Thị Hằng, Nông Văn Hải (2004), “ Nghiên
cứu đa hình một số giống tằm dâu bằng kỹ thuật RAPD”, Di truyền học và ứng
dụng, 2004, tr. 1159 – 1163.
3. Nguyễn Thị Thanh Bình, Đinh Thị Ngọc Thúy, Ngô Lê Thương, Trịnh Hữu
Hằng (2005), “Nghiên cứu đa dạng phân tử của các giống tằm sử dụng trong
sản xuất bằng kỹ thuật PCR – RAPD, Báo cáo khoa học – Hội nghị khoa học
toàn quốc 2005, NXB Khoa học và Kỹ thuật, tr. 76 – 79.
4. Nguyễn Thị Thanh Bình, Đinh Thị Ngọc Thuý, Ngô lê Thương, Trịnh Hữu
Hằng (2005), “Nghiên cứu đa dạng phân tử của các giống tằm sử dụng trong
sản xuất bằng kỹ thuật PCR - RAPD”, Báo cáo khoa học - Hội nghị khoa học
toàn quốc 2005, NXB Khoa học và Kỹ thuật, tr. 76 - 79.
5. Nguyễn Thị Thanh Bình, Đinh Thị Ngọc Thuý, Trần Thị Bích Hồng (2008),
“Nghiên cứu đa dạng di truyền và ưu thế lai của một số giống tằm dâu Bombyx
mori L. bằng chỉ thị phân tử”, Tạp chí Công nghệ sinh học 6, tr. 643 – 648
6. Nguyễn Thị Thanh Bình, Đinh Thị Ngọc Thuý (2008), “Sử dụng kỹ thuật ISSR
nghiên cứu sự liên quan giữa chỉ thị phân tử với chất lượng kén và sức sống của
tămg dâu Bombyx mori”, Báo cáo khoa học - Hội nghị Côn trùng học toàn quốc
lần thứ 6, NXB Nông nghiệp, tr. 845 – 851.
7. Nguyễn Thị thanh Bình, Đinh Thị Ngọc Thúy (2008), “Nghiên cứu sự liên kết
giữa chỉ thị ISSR với năng suất kén của tằm dâu Bombyx mori L. để hỗ trợ cho
công tác giống”, Hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ 4, tr. 147-150.
Nguyễn Thị Lan 78
9. Hồ Huỳnh Thuỳ Dương (2003), Sinh học phân tử, NXB Giáo dục
10. Đặng Đình Đàn, Nguyễn Thị Thanh Bình (2008), “Kết hợp giữa phương pháp
truyền thống với dấu chuẩn phân tử SSR - anchored nghiên cứu xác định độ
thuần của một số giống tằm và tổ hợp lai đang chọn tạo”, Báo cáo khoa học - Hội
nghị Côn trùng học toàn quốc lần 6, NXB Nông nghiệp, tr. 906 - 913.
11. Vũ Thị Thu Hiền, Đinh Thị Phòng (2010),“Phân tích tính đa hình AND của 8
cặp lai nhị nguyên tằm dâu F1 bằng chỉ thị RAPD”, Tạp chí Khoa học và Phát
triển 2010, 8(3), tr. 402 – 409.