Sau khi tìm ra được thành phần và chương trình chạy cho mồi đặc hiệu, chúng tôi tiến hành so sánh tần số khuếch đại của phân đoạn 1500 bp liên quan đến khả năng chịu nóng ẩm cao khi sử dụng mồi đặc hiệu và mồi ISSR. Kết quả được trình bày ở bảng 16:
Bảng 16. So sánh tần số khuếch đại của phân đoạn 1500bp khi sử dụng hai loại mồi (%)
Khuếch đại đoạn DNA kích thƣớc 1500 bp
Sử dụng mồi đặc hiệu Sử dụng mồi ISSR
Tần số khuếch đại 20/20 17/20
Tỷ lệ (%) 100,0 85,0
Từ bảng 16 cho thấy, mồi đặc hiệu khuếch đại được 20/20 mẫu, đạt 100%, còn mồi ISSR 17/20 mẫu cho sản phẩm, đạt 85%. Như vậy, tần số khuếch đại đoạn DNA kích thước 1500 bp ở mồi đặc hiệu cao hơn mồi ISSR 15%. Kết quả nhận được của chúng tôi lặp lại kết quả đã công bố về chỉ thị phân tử liên quan đến năng suất chất lượng tơ kén của tằm dâu [6], [19], như vậy có thể thấy rằng mồi đặc hiệu có độ nhậy cao hơn mồi ISSR.
Sau đó, mồi đặc hiệu tiếp tục được kiểm tra đánh giá trên 3 dòng tằm có khả năng chịu nóng ẩm cao và 3 dòng không có khả năng này. Kết quả nhận được trình bày ở bảng 17. Bảng 17 cho thấy, tần số xuất hiện của phân đoạn 1500bp trên các cá thể của mỗi dòng tằm đều đạt 100% ở những dòng có khả năng chịu nóng ẩm cao, còn ở những dòng không có khả năng này thì phân đoạn 1500bp không khuếch đại.
Nguyễn Thị Lan 74
Bảng 17. Tần số suất hiện phân đoạn 1500bp trên các dòng tằm
Khả năng chịu nóng ẩm cao
Có khả năng Không có khả năng
Tần số xuất hiện của phân đoạn 1500bp trên các cá thể của mỗi dòng tằm
30/30 0
Tỷ lệ (%) 100,0 0
Với những kết quả nhận được như trên có thể thấy rằng phân đoạn 1500bp liên quan đến tính trạng về khả năng chịu nhiệt độ và ẩm độ cao của giống tằm và cặp lai. Do vậy, phân đoạn 1500bp được coi là chỉ thị phân tử liên quan đến tính trạng chống chịu này.
Tiếp theo, chỉ thị phân tử TD1500 được khảo sát trên 20 mẫu giống tằm trong đó có 5 cặp lai tam nguyên (là cặp lai có sự tham gia của giống có khả năng chịu nóng ẩm cao), kết quả trình bày trên hình 23. Hình 23 cho thấy, phân đoạn 1500bp được khuếch đại trên 100% mẫu khảo sát, đạt tỷ lệ tuyệt đối. Kết quả của chúng tôi phù hợp với số liệu của đơn vị quản lý, đánh giá giống theo phương pháp truyền thống. Do đó, chỉ thị TD1550 có thể dùng để đánh giá khả năng chịu nhiệt, ẩm độ cao của giống tằm và cặp lai.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
1500bp
Hình 23. Ảnh điện di sản phẩm PCR
M: Marker 1kb của fermentas 1-15: Mẫu giống tằm có khả năng chịu ẩm và nhiệt độ cao
Nguyễn Thị Lan 75
Chỉ thị phân tử TD1500 được tiếp tục đánh giá sự di truyền trên các thế hệ và kết quả trình bày ở hình 24.
Kết quả hình 24 cho thấy, chỉ thị phân tử TD1500 được di truyền từ thế hệ bố mẹ sang F1 tam nguyên, khi được khuếch đại ở tất cả các mẫu giống.
Như vậy với những kết quả nhận được về tần số xuất hiện cao nhất, đạt 100% của chỉ thị phân tử TD1500 và sự di truyền của chúng qua các thế hệ, có thể khảo nghiệm nhằm đưa vào sử dụng trong công tác giống, để tuyển chọn giống và cặp lai theo tính trạng chống chịu nóng ẩm cao bằng chỉ thị phân tử.
Theo phương pháp truyền thống, để đánh giá năng suất chất lượng tơ kén và khả năng chống chịu nóng ẩm cao của giống và cặp lai cần khoảng thời gian dài nuôi tằm, theo dõi các chỉ tiêu bằng phương pháp thường quy như đếm số tằm, đếm và cân số kén thu được của từng lô, của các giống bố mẹ, các cặp lai… nên bị ảnh hưởng rất lớn bởi ngoại cảnh, trong khi đó sử dụng marker phân tử chỉ cần 1 đến 2 ngày đã có thể biết được kết quả. Như vậy đánh giá giống bằng chỉ thị phân tử sẽ nhận được kết quả nhanh hơn so với phương pháp truyền thống, lại không bị ảnh hưởng bởi các yếu tố bên ngoài. Đây là những kết quả nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam theo hướng này, có thể sử dụng để tuyển chọn giống tằm có khả năng chịu nóng ẩm cao.
1500bp
Hình 24. Ảnh điện di sản phẩm PCR
M: Marker 1kb của fermentas 1-10:Mẫu giống bố 11-20: Mẫu giống mẹ
21-40: Mẫu F1 tam nguyên
21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 M 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Nguyễn Thị Lan 76
KẾT LUẬN
1. Sử dụng 15 mồi ISSR phân tích đa hình 30 giống tằm thuộc hai nhóm có khả
năng chịu nóng ẩm cao khác nhau, đã nhận được 2216 phân đoạn, trong đó có 1766 phân đoạn đa hình, tỷ lệ đa hình chiếm 79,69% thể hiện nguồn gen phân tích phong phú. Mồi P1, P2, P7, P9 có tỷ lệ đa hình cao nhất đạt 100%, mồi P5 không cho đa hình. HSTĐDT giữa các giống dao động từ 0,55 đến 0,95. Sơ đồ phân loại chia 30 giống tằm thành hai nhóm riêng biệt theo khả năng chịu nóng ẩm cao khác nhau.
2. Xác định được phân đoạn 1500bp có khả năng liên quan đến khả năng chịu
nhiệt độ và ẩm độ cao. Phân đoạn này đã được dòng hóa và xác định trình tự. Độ tương đồng của một phần phân đoạn 1500bp với các mã số dbj|AP009031.1|, gb|DQ243612.1| và dbj|AP009027.1| dao động từ 90 % đến 95% khi so sánh trên Genbank.
3. So sánh tần số khuếch đại phân đoạn khi sử dụng mồi đặc hiệu và mồi ISSR,
theo đó mồi đặc hiệu cho hiệu quả cao hơn mồi ISSR, phân đoạn 1550bp được khuếch đại với tần số 100% bằng mồi đặc hiệu và 85% bằng mồi ISSR.
4. Kiểm tra phân đoạn đặc hiệu trên 20 giống tằm nguyên liệu trong đó có 5 cặp
lai tam nguyên của Trung tâm Nghiên cứu Thực nghiệm Nông Lâm nghiệp Lâm Đồng. Phân đoạn 1500bp được khuếch đại trên 100% số mẫu giống được đánh giá bằng phương pháp truyền thống có khả năng chịu nóng ẩm cao.
5. Chỉ thị TD1500 được di truyền từ thế hệ bố mẹ đến F1 tam nguyên.
ĐỀ NGHỊ
Được tiếp tục hướng nghiên cứu này với việc thử nghiệm phân đoạn đặc hiệu của mồi thiết kế trên số lượng mẫu lớn hơn, để có thể sử dụng các phân đoạn đặc hiệu này làm marker phân tử đánh giá giống theo khả năng chịu với nhiệt độ và ẩm độ cao.
Nguyễn Thị Lan 77
TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Lê Trần Bình, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải, Trương Nam Hải, Lê Quang Huấn
(2003), Áp dụng các kỹ thuật phân tử trong nghiên cứu tài nguyên sinh vật Việt
Nam, NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.
2. Nguyễn Thị Thanh Bình, Hoàng Thị Hằng, Nông Văn Hải (2004), “ Nghiên
cứu đa hình một số giống tằm dâu bằng kỹ thuật RAPD”, Di truyền học và ứng
dụng, 2004, tr. 1159 – 1163.
3. Nguyễn Thị Thanh Bình, Đinh Thị Ngọc Thúy, Ngô Lê Thương, Trịnh Hữu
Hằng (2005), “Nghiên cứu đa dạng phân tử của các giống tằm sử dụng trong
sản xuất bằng kỹ thuật PCR – RAPD, Báo cáo khoa học – Hội nghị khoa học
toàn quốc 2005, NXB Khoa học và Kỹ thuật, tr. 76 – 79.
4. Nguyễn Thị Thanh Bình, Đinh Thị Ngọc Thuý, Ngô lê Thương, Trịnh Hữu
Hằng (2005), “Nghiên cứu đa dạng phân tử của các giống tằm sử dụng trong
sản xuất bằng kỹ thuật PCR - RAPD”, Báo cáo khoa học - Hội nghị khoa học
toàn quốc 2005, NXB Khoa học và Kỹ thuật, tr. 76 - 79.
5. Nguyễn Thị Thanh Bình, Đinh Thị Ngọc Thuý, Trần Thị Bích Hồng (2008),
“Nghiên cứu đa dạng di truyền và ưu thế lai của một số giống tằm dâu Bombyx
mori L. bằng chỉ thị phân tử”, Tạp chí Công nghệ sinh học 6, tr. 643 – 648
6. Nguyễn Thị Thanh Bình, Đinh Thị Ngọc Thuý (2008), “Sử dụng kỹ thuật ISSR
nghiên cứu sự liên quan giữa chỉ thị phân tử với chất lượng kén và sức sống của
tămg dâu Bombyx mori”, Báo cáo khoa học - Hội nghị Côn trùng học toàn quốc
lần thứ 6, NXB Nông nghiệp, tr. 845 – 851.
7. Nguyễn Thị thanh Bình, Đinh Thị Ngọc Thúy (2008), “Nghiên cứu sự liên kết
giữa chỉ thị ISSR với năng suất kén của tằm dâu Bombyx mori L. để hỗ trợ cho
công tác giống”, Hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ 4, tr. 147-150.
Nguyễn Thị Lan 78
9. Hồ Huỳnh Thuỳ Dương (2003), Sinh học phân tử, NXB Giáo dục
10. Đặng Đình Đàn, Nguyễn Thị Thanh Bình (2008), “Kết hợp giữa phương pháp
truyền thống với dấu chuẩn phân tử SSR - anchored nghiên cứu xác định độ
thuần của một số giống tằm và tổ hợp lai đang chọn tạo”, Báo cáo khoa học - Hội
nghị Côn trùng học toàn quốc lần 6, NXB Nông nghiệp, tr. 906 - 913.
11. Vũ Thị Thu Hiền, Đinh Thị Phòng (2010),“Phân tích tính đa hình AND của 8
cặp lai nhị nguyên tằm dâu F1 bằng chỉ thị RAPD”, Tạp chí Khoa học và Phát
triển 2010, 8(3), tr. 402 – 409.
12. Nguyễn Văn Long, Nguyễn Huy Trí, Bùi Thị Điểm, Trần Thị Ngọc (2004),
Giáo trinh Dâu tằm – Ong mật, NXB Nông Nghiệp
13. Lê Đình Lương, Quyền Đình Thi (2003), Kỹ thuật di truyền và ứng dụng, NXB
Đại học Quốc gia Hà Nội.
14. Nguyễn Thị Minh Nguyệt, Trịnh Hữu Hằng, Nguyễn Thị Thanh Bình (2005),
“Phân tích đa hình phân tử một số giống tằm dâu lưỡng hệ (Bombyx mori L.)
bằng kỹ thuật RAPD”, Báo cáo khoa học - Hội nghị côn trùng toàn quốc lần
thứ 5, NXB Nông nghiệp, tr. 669 – 673.
15. Đinh Thị Phòng, Nguyễn Thị Đảm (2009), “Đánh giá độ thuần 10 giống tằm
Bombyx mori L. bằng chỉ thị RAPD”, Tạp chí Khoa học và Phát triển 2009, 7(5), tr. 620 – 627.
16. QCVN 01 -74: 2011/BNNPTNT, Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về khảo nghiệm,
kiểm định giống tằm.
17. Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Phương Thảo (2005),
Giáo trình công nghệ sinh học nông nghiệp. Nxb Nông Nghiệp.
18. Khuất Hữu Thanh (2003), Cơ sở di truyền phân tử và kỹ thuật gen, NXB Khoa
Nguyễn Thị Lan 79
19. Đinh Thị Ngọc Thúy, Nguyễn Thị Thanh Bình (2010), “Phát triển chỉ thị PCR –
ISSR liên quan với năng suất chất lượng tơ kén tằm dâu (Bombyx mori L.)”,
Hội nghị Khoc học kỷ niệm 35 năm Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam – Hà Nội 10/2010.
20. Nguyễn Huy Trí, Lê Thị Kim (1996), Giáo trình chế biến sản phẩm phụ dâu –
tằm – tơ, NXB Nông nghiệp.
21. Viện nghiên cứu và phát triển ngành nghề nông thôn Việt Nam (VIRI ) (2010),
Kỹ thuật trồng dâu và nuôi tằm, Hà Nội.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
22. Arvind K Awasthi, GM Nagaraja, GV Naik, Sriramana Kanginakudru, K
Thangavelu, and Javaregowda Nagaraju (2004), Genetic diversity and
relationships in mulberry (genus Morus) as revealed by RAPD and ISSR marker assays, BMC Genetics 2004, pp.1471-2156
23. Appukuttan R. Pradeep, Shankar N. Chatterjee, Chirakkara V. Nair (2005)
Genetic differentiation induced by selection in an inbred population of the silkworm Bombyx mori, revealed by RAPD and ISSR marker systems, J Appl Genet, 46(3), 2005, pp. 291-298.
24. Appukuttannair R Pradeep, Anuradha H Jingade and Raje S Urs (2007),
Molecular Markers for Biomass Traits: Association, Interaction and Genetic Divergence in SilkwormBombyx mori, Biomarker Insights 2007, pp.197–217
25. Chatterjee S.N., Pradeep A.R. (2003), Molecular markers (RAPD) associated
with growth, yield and origin of the silkworm (Bombyx mori L.) in Indian, Genetika, 39(12), pp.1612 – 1624.
26. Desmond S. T. Nicholl (2008), An introduction to Genetic engineering – third
Nguyễn Thị Lan 80
27. J. Nagaraju and M.R. Goldsmith (2002), Silkworm genomics – progress and
prospects, Science, Current science, Vol 83, No 4., pp 415 – 416.
28. J. Nagaraju and M. R. Goldsmith (2002), Silkworm genomics - progress and
prospects, Science, Current science, Vol 83, No 4., pp 415 - 416.
29. Li B., Lu C., Zhou Z.Y., Xiang Z.H. (2000), Construction of silkworm RAPD
molecular linkage map, Yi Chuan Xue Bao, 27(2), pp.127 – 132.
30. Li B., Lu C., Zhou Z.Y., Xiang Z.H. (2000), Construction of silkworm RAPD
molecular linkage map, Yi Chuan Xue Bao, 27(2), pp.127 – 132.
31. Li B., Xia Q., Lu C., Zhou Z., Xiang Z. (2004), Analysis on frequence and
density of microsatellites in coding sequences of several eukaryotic genomes, Genomeics Proteomics Bioinformatics, 2(1), pp.24 – 31.
32. Lu C., Li B., Zhao A., Xiang Z. (2004), QLT mapping of economically
important traits in silkworm (Bombyx mori L.), Sci China C Life Sci, 47(5), pp.477 – 484.
33. Muwang Li, Chengxiang hou, Xuexia Miao, Anying Xu and Yongping Huang,
(2007) Analyzing Genetic Relationships in Bombyx mori Using Intersimple
Sequence Repeat Amplification, Journal of Economic Entomology 2007, pp. 202-208.
34. Nguyen Thi Thanh Binh, Krasimira Malinova (2008) Correlation between
ISSR Markers and cocoon quality in a mulberry silkworm, Bombyx mori L., First Balkan workshop, pp. 47-52
35. Reddy K.D., Nagaraju & Abraham (2001), Genetic characterization of the
silkworm (Bombyx mori L.) by simple sequence repeat (SSR) – anchored PCR, Heredity, 86(5), pp.588.
36. Salima Machkour-M’Rabet, Yann He´naut, Ariane Dor, Gabriela Pe´rez-
Lachaud, Ce´line Pe´lissier, Charles Gers and Luc Legal, (2009), ISSR (Inter
Nguyễn Thị Lan 81
tarantulas (Araneae, Mygalomorphae), The Journal of Arachnology 37, pp. 10– 14.
37. Seyed Benyamin Dalirsefat, Seyed Ziyeddin Mirhoseini (2007), Assessing
genetic diversity in Iranian native silkworm (Bombyx mori L.) strains and Japanese commercial lines using AFLP markers, Iranian Journal of Biotechnology, Vol. 5, No. 1, 2007.
38. Tan Y.D., Wan C., Zhu Y., Lu C., Xiang Z., Deng H.W. (2001), An amplified
fragment length polymorphism map of the silkworm, Genetics, 157(3), pp.1277 – 1284.
39. Zhao A.C., Lu C., Li B., Pu X.Y., Zhou Z.Y., Xiang Z.H. (2004), Construction of
AFLP molecular makers linkage map and localization of green cocoon gene in silkworm (Bombyx mori L.), Yi Chuan Xue Bao, 31(8), pp.787 – 794.
40. Weiguo Zhao, Rongjun Fang , Yile Pan , Yonghua Yang , Jong-Wook Chung
.... (2009), Analysis of genetic relationships of mulberry (Morus L.)
germplasm using sequence-related amplified polymorphism (SRAP) markers,
African Journal of Biotechnology Vol. 8 (11), pp. 2604-2610
TRANG WEB 41. http://www.silk4world.com/component/content/article/1-latest-news/62-lua-to- tam.html 42. http://www.bio.davidson.edu/COURSES/genomics/method/RFLP.html 43. http://vi.wikipedia.org/wiki/T%E1%BA%B1m_t%C6%A1) 44. http://www.haiduongdost.gov.vn/nongnghiep/?menu=news&catid=4&itemid=2 1 45. http://www.tinsuckhoe.com/y-hoc-dan-toc/cay-thuoc-vi-thuoc/vi-thuoc-tu- phan-tam.nd5-dt.62963.006051.html
Nguyễn Thị Lan 82 46. http://duybiotech.wordpress.com/2010/08/29/cac-k%E1%BB%B9- thu%E1%BA%ADt-pcr-va-%E1%BB%A9ng-d%E1%BB%A5ng/ 47. http://www.bio.davidson.edu/courses/genomics/method/RFLP.html 48. http://en.wikipedia.org/wiki/Amplified_fragment_length_polymorphism 49. http://www.studentsguide.in/industrial-microbial-biotechnology/microbes- microbial-genomics-for-industry/sericulture-biotechnology.html
50. http://en.wikipedia.org/wiki/Inter simple sequence repeat
51. http://www.ingentaconnect.com/search/article?title=ISSR- PCR&title_type=tka&year_from=1998&year_to=2007&database=1&pageSize =2 52. http://www.vaas.org.vn/index.php?option=com_content&task=view&id=425&I te 53. http://avery.rutgers.edu/WSSP/StudentScholars/project/archives/onions/rapd.ht ml 54. http://svdanang.com/@pbkok/showthread.php?t=22275