CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số
Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng phương pháp tách chiết và tinh sạch DNA theo tài liệu của Wiliam và cộng sự, tham khảo thêm tài liệu của một số tác giả khác, có cải tiến cho phù hợp với đối tượng nghiên cứu và điều kiện phòng thí nghiệm.
Qui trình tách chiết và tinh sạch DNA được tiến hành theo các bước sau:
Nguyễn Thị Lan 44
Nghiền khoảng 100mg mẫu mô nhộng thành dạng bột mịn, sau đó cho khoảng 900àl lysis cell solution và chuyển mẫu sang ống eppendorf khỏc.
Bổ sung 8àl proteinase K (20mg/ml) rồi đảo đều và ủ mẫu qua đờm ở nhiệt độ 560C. Đây là nhiệt độ tối ưu cho proteinase K hoạt động. Hỗn hợp lysis cell solution và proteinase K sẽ phá vỡ màng tế bào và màng nhân, giải phóng DNA ra môi trường đồng thời phân huỷ các protein liên kết với DNA.
Bổ sung tiếp 4,5àl RNase (20mg/ml) để loại bỏ ARN. Đảo đều và ủ mẫu ở 370C trong khoảng 2 - 3h, đây là nhiệt độ hoạt động tối ưu của RNase.
Bổ sung 450àl muối CH3COONH4 (7,5M) đảo đều và tủa trong lạnh khoảng 2h - 3h. Protein sẽ được loại bỏ khỏi dung dịch dưới dạng tủa.
Ly tâm 13000 vòng/phút trong 15 phút. Bỏ tủa, hút dịch trong sang ống eppenforf mới.
Bổ sung 450àl phenol: choroform: isoamyl alcohol (25:24:1), dung dịch này có tác dụng làm biến tính protein nhưng không hoà tan DNA. Lắc đều và ly tâm mẫu 13000 vòng/phút trong 20 phút. Khi đó protein biến tính sẽ tủa thành một lớp nằm giữa pha dịch DNA và pha phenol: choroform: isoamyl alcohol. Pha nước có chứa DNA sẽ được thu nhận lại bằng cách hút chuyển dịch sang ống eppendorf mới.
Bổ sung 450àl chloroform: isoamyl alcohol rồi tiến hành cỏc bước giống như khi cho phenol: chloroform vào. Cuối cùng thu được dịch chứa DNA.
Dịch DNA thu được ở trờn cho vào eppendorf chứa 850àl ethanol 100% và 40àl CH3COONa, đảo đều và để tủa trong ngăn đỏ qua đờm.
Ly tâm 13000vòng/phút trong 20 phút, thu tủa DNA.
Rửa trong 400àl cồn 70% để loại bỏ muối và chloroform: isoamyl alcohol còn sót lại trong mẫu.
DNA thu được làm khô trong máy Speed Vac khoảng 10 phút.
Nguyễn Thị Lan 45
Bảo quản DNA trong TE ở -200C
2.2.2. Định lƣợng DNA bằng quang phổ kế
Sau khi thu nhận DNA ở dạng sạch, tiếp tục tiến hành phân tích định tính và định lượng DNA bằng quang phổ kế.
Nguyên tắc của phương pháp quang phổ kế
Phương pháp định lượng DNA bằng quang phổ kế dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng λ = 260nm của các bazơ purine và pyrimidine. Dựa trên nguyên tắc này, cho phép xác định được nồng độ và độ tinh sạch của DNA được tách chiết.
Nồng độ DNA
Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260nm (OD260nm - Optical Density 260nm) của các mẫu đo cho phép xác định nồng độ DNA trong mẫu dựa vào tương quan :
Một đơn vị OD260nm tương ứng với một nồng độ là: 50àg/ml cho một dung dịch sợi đôi.
Nồng độ tương đối của DNA được tính theo công thức : C = OD260nm ì d0 ì So (1)
C : Nồng độ tương đối của DNA d0 : Độ pha loãng
S0 : Hằng số, S0 = 50
Độ sạch của DNA
Để kiểm tra độ sạch của DNA trong dung dịch, cần đo thêm OD ở 280nm đây là bước sóng các protein có mức hấp thụ cao nhất, nhưng các protein cũng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 260nm như các DNA và do đó làm sai lệch giá trị thật của nồng độ DNA. Tiếp theo tính tỷ số OD260nm/OD280nm (2), DNA được xem là sạch khi tỷ số OD260nm/OD280nm nằm trong khoảng 1,8 - 2,0.
Nguyễn Thị Lan 46
Các bước tiến hành:
Pha loãng DNA 200 lần.
Lấy 1ml nước khử vô trùng làm đối chứng.
Đo lần lượt các mẫu DNA đã pha loãng ở các bước sóng 260nm và 280nm.
Sau đó, tính nồng độ và độ sạch của DNA theo (1) và (2).
Phương pháp định lượng bằng quang phổ kế cho phép ước lượng tương đối nồng độ DNA có trong mẫu.
2.2.3. Điện di trên gel Agarose
Nguyên tắc điện di
Điện di là kỹ thuật được sử dụng trong thí nghiệm để phân tích các đại phân tử tích điện. Trong phòng thí nghiệm sinh học phân tử người ta thường sử dụng phương pháp điện di để tách ly, phát hiện phân tử DNA tổng số, DNA bị cắt hạn chế và DNA của sản phẩm PCR.
Acid nucleotide là phân tử tích điện âm, vì vậy, chúng có thể dịch chuyển qua bản gel từ cực âm sang cực dương dưới tác động của điện trường. Trên cùng một bản gel, có cùng một dòng điện những phân tử DNA khác nhau về trọng lượng nên khác nhau về điện tích và chạy được những quãng đường khác nhau sau một thời gian như nhau. Sau khi phân tách bằng điện di, để phát hiện phân tử DNA người ta dùng phương pháp làm hiện hình bằng nhuộm. Đối với gel agarose, nhuộm bằng ethidium bromide, sẽ gắn xen các bazơ của phân tử DNA và phát quang dưới tia tử ngoại. Khi điện di kiểm tra DNA, thường sử dụng thang DNA chuẩn cùng với mẫu nghiên cứu, từ đó có thể biết trọng lượng phân tử của các DNA khác nhau.
Các bước điện di được tiến hành như sau
Đổ gel: Với DNA tổng số chuẩn bị gel 0,8% , sản phẩm PCR chuẩn bị gel 1,2% trong đệm TAE.
Chuẩn bị mẫu cho vào từng giếng: Điện di DNA tổng số, tra 3àl mẫu đó trộn
Nguyễn Thị Lan 47
đều cựng 1àl loading dye. Với sản phẩm PCR, 6àl trộn với 1àl loading dye. Mix đều, rồi tra mẫu vào giếng điện di. Marker được sử dụng để xác định kích thước của DNA là marker lambda DNA/EcoRI + HindIII hoặc marker 1kb và 100bp cho sản phẩm PCR.
Tiến hành điện di: Đặt các thông số cho điện di (hiệu điện thế U = 100V;
thời gian khoảng 30 - 45 phút).
Nhuộm ethidium bromide, đem soi dưới tia UV xem băng vạch, DNA bắt màu thuốc nhuộm sẽ hiện lên dưới dạng các băng vạch màu da cam, quan sát và chụp ảnh sản phẩm điện di.
2.2.4. Phương pháp PCR – ISSR
Các thành phần của phản ứng PCR – ISSR được trình bày trong bảng 6:
Bảng 6. Thành phần của phản ứng PCR – ISSR Thành phần Thể tớch (àl) Nước khử ion vô trùng 10,15
Buffer (10X) 2
MgCl2 (25àM) 1,6
dNTP (2mM) 2
Mồi (2,5àM) 1,9
Taq polymerase 0,35
DNA (20ng/àl) 2
Tổng thể tích 20
Các thành phần của phản ứng được trộn nhẹ nhàng trong ống eppendorf 0,5ml, tránh hiện tượng tạo bọt. Sau đó ống eppendorf chứa hỗn hợp các thành phần của phản ứng được xếp vào máy PCR và chạy theo chu kỳ nhiệt.
Nguyễn Thị Lan 48
Bảng 7. Chu trình PCR-ISSR
Bước Chu trình Giai đoạn Nhiệt độ (0C) Thời gian
1 Biến tính ban đầu 94 2 phút
2 Lặp lại 35 chu kỳ
Biến tính 94 30 giây
Gắn mồi 50 30 giây
Kéo dài mạch 72 2 phút
Hoàn tất kéo dài mạch 72 10 phút
3 Kết thúc phản ứng 4 10phút ∞
2.2.5. Xử lý số liệu
Sử dụng phần mềm NTSYS
Bước 1: Đọc kết quả qua ảnh điện di sản phẩm PCR
Các số liệu được thống kê thông qua ảnh điện di sản phẩm PCR. Những phân đoạn (PĐ) được nhân bản và quan sát thấy trong bản gel điện di được kí hiệu là 1, không quan sát thấy kí hiệu là 0. PĐ đơn hình là PĐ xuất hiện ở tất cả các giống.
PĐ đa hình là PĐ chỉ xuất hiện ở một hoặc một số giống này mà không xuất hiện ở các giống khác. PĐ đặc trưng là những PĐ chỉ xuất hiện ở một giống. Qua đó tính được số PĐ được nhân trên mồi, tổng số PĐ và số PĐ đa hình được nhân.
TLĐH đối với mồi được xác định thông qua công thức : TLĐH = PĐĐH / TSPĐ
TLĐH: Tỷ lệ đa hình đối với một mồi
PĐĐH : Số lượng PĐ đa hình được nhân lên khi sử dụng mồi đó.
TSPĐ: Tổng số PĐ được nhân lên với mồi đó.
Bước 2: Xác định hệ số tương đồng di truyền và thiết lập cây quan hệ
Nguyễn Thị Lan 49
Sử dụng phần mềm NTSYS 2.0. xác định hệ số tương đồng di truyền và xây dựng sơ đồ quan hệ chủng loại.
Xác định hệ số PIC
Hệ số PIC là hàm lượng thông tin tính đa hình (Polymorphism Information Content) thể hiện sự đa dạng di truyền của các alen ở từng locus. Hệ số PIC (Polymorphic Information Content) được tính theo công thức sau:
PIC=1- Pi2 trong đó Pi là tần số xuất hiện của alen thứ i
Phương pháp DNASTAR
Sau khi xác định trình tự, kết quả được xử lý trong phần mềm DNAStar, phần mềm này cho các dữ liệu mong muốn về trình tự nucleotid, amino acid, cây di truyền phân loài giúp phân tích, so sánh.
2.2.6. Phương pháp thôi gel
Bằng phương pháp này ta có thể loại bỏ các băng phụ, các tạp chất và nhận được đúng phân đoạn mong muốn, nó sẽ làm tăng hiệu suất gắn sản phẩm PCR vào vector.
Các bươc tiến hành :
Điện di sản phẩm PCR-ISSR, nhuộm bằng ethidium bromide.
Cắt đúng phân đoạn mình mong muốn, cho vào eppendorf 1,5ml.
Cho 900μl Binding buffer và ủ 550C trong 5’ cho tan hết gel.
Cho 230μl isopropanol, đảo đều để tủa DNA, bổ sung 500μl Binding buffer Ly tâm 13000v/phút, đổ dịch.
Rửa 500μl wash buffer.
Ly tâm 13000v/phút, đổ dịch.
Ly tâm lại 13000v/phút để dịch xuống hết, đổ dịch.
Cho 25μl nước khử ion vô trùng, để 2 phút, chuyển sang eppendorf mới.
Nguyễn Thị Lan 50
Ly tâm 13000v/phút, thu đoạn DNA mong muốn.
Điện di kiểm tra trên gel Agarose và bảo quản mẫu ở -200C.
2.2.7. Tạo plasmid tách dòng
Sau khi thu được sản phẩm PCR, tiến hành gắn sản phẩm vào vector pJET 1.2. Thành phần của phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector pJET 1.2. được trình bày trong bảng 8:
Bảng 8: Phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector pJET 1.2
Thành phần Thể tớch (àl)
Buffer 10x 1,5
Biến tính ở 700C trong 15 phút
Blunting E 0,5
Nước khử ion vô trùng 3,75
Sản phẩm PCR 3,0
PjET 1.2. 0,75 Ủ ở 220C trong 2 giờ
T4 ligase 0,5
Tổng thể tích 10,0
2.2.8. Biến nạp sản phẩm vào E.coli DH5α
Để tạo được nhiều bản sao, plasmid tách dòng được biến nạp vào tế bào E.coli DH5α theo phương pháp sốc nhiệt
Các bước tiến hành:
Lấy tế bào khả biến từ tủ -850C, đặt trên đá 30 phút.
Bổ sung 7,5àl sản phẩm ligation vào ống Eppendporf cú chứa 100 àl tế bào khả biến.
Hỗn hợp tế bào, sốc nhiệt plasmid ở nhiệt độ 420C trong 45 giây.
Nguyễn Thị Lan 51
Bổ sung 250 àl mụi trường LB lỏng, nuụi lắc 200 vũng/phỳt ở 370C trong 1 giờ.
Cấy trải trên đĩa petri chứa môi trường LB đặc có bổ sung thêm Ampixilin (tỷ lệ Ampixilin (100mg/ml): LB đặc là 1:1000).
Nuôi khoảng 14 – 16 giờ ở tủ ấm 370C.
2.2.9. Chọn lọc và nuôi dòng tế bào có khả năng mang đoạn gen biến nạp
Sau khi ủ ở 370C khoảng 14 – 16 giờ, các khuẩn lạc màu trắng đục xuất hiện trên đĩa thạch. Tiến hành chọn lọc những khuẩn lạc to, tròn, màu trắng đục là những dòng có khả năng mang gen mục tiêu.
Mỗi khuẩn lạc sau khi chọn được nuôi trong 1 lọ penicillin có chứa 1,5ml mụi trường LB lỏng và 1,5àl Ampixilin (tỉ lệ Ampicillin: LB là 1:1000).
Bọc lọ penicillin bằng giấy bạc, sản phẩm được nuôi lắc trong môi trường LB lỏng với tốc độ 200 vòng/phút ở 370C trong vòng 16 giờ.
2.2.10. Phương pháp tách chiết DNA plasmid
Vi khuẩn được nuôi và nhân lên đến giai đoạn cuối cùng của pha log. Tế bào được phá vỡ bằng kiềm và chất tẩy mạnh. DNA plasmid được thu lại bằng cách kết tủa với ethanol.
Các bước tiến hành:
Chuyển dịch chứa plasmid trong lọ penicillin vào ống eppendorf 1,5ml.
Ly tâm 6500 vòng/phút trong 5 phút để thu tế bào, loại bỏ LB.
Bổ sung 150àl dung dịch Sol I, voltex kỹ để làm tan tế bào.
Bổ sung tiếp 150àl dung dịch Sol II, đảo kỹ để phỏ vỡ tế bào.
Thờm 150àl dung dịch Sol III, đảo đều để tủa protein.
Nguyễn Thị Lan 52
Ly tâm 13000 vòng/phút trong 15 phút, loại bỏ protein và genomic DNA bằng cách hút dịch chứa plasmid sang ống eppendorf khác.
Bổ sung 900àl cồn 100%, tủa ở -200C trong vũng 2 giờ.
Ly tâm 13000 vòng/phút trong 20 phút, thu tủa.
Rửa tủa bằng 450àl cồn 70% nhằm loại bỏ muối và tạp chất.
Ly tâm 13000 vòng/phút trong vòng 10 phút, thu tủa.
Làm khô DNA bằng máy Speed vac trong khoảng 10 phút.
Bổ sung 40àl H2O–RNAase vụ trựng để hũa tan DNA plasmid.
2.2.11. Cắt plasmid bằng enzym giới hạn
Để chắc chắn rằng đoạn gen liên quan đến tính chống chịu đã được gắn vào vector Pjet1.2 hay chưa, tiến hành kiểm tra kết quả gắn bằng enzyme cắt giới hạn.
Plasmid tái tổ hợp chứa gene đích, khi cắt bằng enzym hạn chế thích hợp, sẽ biểu thị đoạn gene quan tâm và vector mở vòng với kích thước tương ứng theo lý thuyết.
Các enzym này thường được thiết kế ở hai đầu mút của đoạn gen ngoại lai. Thành phần của phản ứng được cụ thể trong bảng 8:
Bảng 8. Phản ứng cắt hạn chế plasmid tái tổ hợp
Thành phần Thể tớch (àl)
Nước khử ion vô trùng 4,5 Buffer tango II 2,0
XbaI 0,25
XhoI 0,25
Plasmid 3,0
Tổng thể tích 10,0
Sản phẩm cắt được ủ ở 370C qua đêm, sau đó điện di kiểm tra trên gel agarose. Chọn những plasmid mang gen mong muốn, tinh sạch và đem giải trình tự.
Nguyễn Thị Lan 53
2.2.12. Tinh sạch plasmid
Trước khi tiến hành đọc trình tự, plasmid phải được tinh sạch. Các bước tiến hành tinh sạch gồm:
Hỳt 40 àl sản phẩm plasmid và 460 àl nước khử ion rồi cho vào ống eppendorf 1,5ml.
Bổ sung thờm 500 àl cloroform, đảo đều
Ly tâm sản phẩm ở 12000 vòng/phút trong 15 phút.
Sản phẩm sau khi ly tâm phân thành 3 lớp: lớp trên cùng là DNA, lớp giữa là protein và lớp dưới cùng là cloroform. Tiến hành hút dịch DNA và bổ sung vào ống eppendorf 1,5ml mới cú chứa 40 àl CH3COONa và 1ml ethanol 100%.
Tủa ở nhiệt độ -200C trong 2 giờ.
Lấy sản phẩm sau khi tủa đem ly tâm với tốc độ 12000 vòng/phút trong 20 phút.
Đổ dịch và thu sản phẩm plasmid.
Bổ sung 400àl cồn 70%, ly tõm 12000 vũng/phỳt trong 10 phỳt.
Bổ sung tiếp 300 àl cồn 70%, ly tõm 12000 vũng/phỳt trong vũng 10 phỳt Làm khô.
Hũa tan plasmid sau khi đó tinh sạch bằng 25 àl nước khử ion.
Điện di 3 àl sản phẩm plasmid + 1,5 àl loading dye.
2.2.13. Phương pháp xác định trình tự gen
Sản phẩm plasmid mang gen mong muốn sau khi tinh sạch đem đọc trình tự trên máy tự động ABI PRISM 3100- Avant Data Collection v1.0 của Mỹ với cặp mồi M13F và M13R được thiết kế cho vector tách dòng, sau đó được phân tích bằng phần mềm CLUSTALX (1.81) và so sánh với trình tự gen trong ngân hàng gen bằng chương trình BLAST.
Nguyễn Thị Lan 54
2.2.14. Phương pháp thiết kế mồi
Dựa vào trình tự DNA của phân đoạn đặc hiệu có khả năng liên quan khả năng chống chịu nhiệt độ và độ ẩm cao. Dùng phần mềm primer 3 để thiết kế cặp mồi đặc hiệu.