Thu nhận đoạn gen OmpN và pPIC9K từ chủng E.coli DH5α

Khi nhận được chủng E. coli BL21 mang đoạn gen OmpN nối với plasmid pGEX4T1 chúng tôi tiến hành tách plasmid và biến nạp vào E. coli DH5α theo phương pháp đã được trình bày ở mục 2.2.2.1.

Sau khi biến nạp thành công pGEX4T1:: OmpN vào E. coli DH5α, thu nhận những khuẩn lạc mọc trên đĩa LB agar có chứa kháng sinh ampicilline, tăng sinh

56

giữ chủng và tách plasmid để kiểm tra cũng và sử dụng cho những thí nghiệm tiếp theo.

Đồng thời, chúng tôi tiến hành tách pPIC9k từ E. coli DH5α bằng bộ kit Miniprep của hãng Qiagen. Sau đó, thực hiện các phản ứng cắt plasmid pGEX4T1:: OmpN và pPIC9K bằng 2 enzyme NotI và EcoRI theo công thức ở phần c, mục 2.2.2.1 và ủ trong 3 giờở 370C.

Kiểm tra kết quả phản ứng cắt bằng điện di trên gel agarose 1%

Hình 3.11. Kết quả điện di trên gel agarose1% plasmid pGEX4T1::OmpN (A)(Giếng1: thang DNA, Giếng 2: plasmid pGEX4T1::OmpN, Giếng 3: plasmid đã được cắt bằng enzyme NotI và EcoRI) và pPICK9K (B)(Giếng 1: thang DNA, Giếng 2: pPIC9k, Giếng 3: pPIC9K được cắt bởi NotI và EcoRI)

Kết quảở hình 3.11 (A) cho thấy giếng 3 có 2 vạch, kích thước tương ứng với kích thước của gen OmpN (~1209 bp) và plasmid pGEX4T1 (~ 4969 bp). Ngoài ra không có vạch phụ xuất hiện, vậy phản ứng cắt đã được thực hiện hoàn toàn.

Ở giếng thứ 3, hình 3.11 (B), xuất hiện một vạch khoảng 9263 bp, tương ứng với kích thước của pPIC9k bị cắt mất một đoạn 13 bp bởi 2 enzyme NotI và EcoRI. Chứng tỏ phản ứng cắt pPIC9K cũng đã được thực hiện hoàn toàn.

Khi các phản ứng cắt đã được thực hiện thành công, tiến hành thu nhận và tinh sạch đoạn gen OmpN bằng bộ kit Gel Extraction Kit của hãng Qiagen. Sản phẩm sau khi tinh sạch được điện di trên gel agarose để kiểm tra

1 2 3 B 1000 bp 1500 bp 4000 bp 5000 bp 10000 bp

57

Hình 3.12. Kết quảđiện di trên gel agarose 1% đoạn gen OmpN đã được tinh sạch;

Giếng1: OmpN đã tinh sạch, Giếng 2: thang DNA

Trên hình 3.12 ta thấy, ở giếng 1 xuất hiện một vạch có kích thước tương ứng với kích thước của gen OmpN (1209 bp). Vạch khá rõ và không xuất hiện vạch phụ. Vậy, đoạn gen OmpN đã được tách và tinh sạch rất tốt, có thể dùng cho các thí nghiệm tiếp theo.