Hoạt độ phân hủy fibrin (FU/ml) của dịch ngoại bào sau nuôi cấy được xác định theo phương pháp trình bày ở mục 2.2.18. Các trường hợp được so sánh là chủng DB104 mang pBG01-aprE, chủng mang plasmid chưa chèn gen (chủng DB104 pBG01) và B. subtilis natto (chủng hoang dại phân lập từ Natto). Các chủng được nuôi cấy lỏng trong môi trường LB và cảm ứng bằng IPTG ngoại trừ chủng hoang dại. Tiến hành thu mẫu tại thời
1 2 3 4 5 6 7 8 9
- 87 -
điểm 3 giờ và 25 giờ sau cảm ứng, ly tâm và thu dịch nổi cho xác định đơn vị hoạt tính. Kết quả thể hiện ở Bảng 3.1.
Thời gian Giá trị trung bình B. subtilis natto B. subtilis DB104- pBG01-aprE B. subtilis DB104-pBG01 Cảm ứng sau 3h Thử không 0,677 0,69 0,82 Thử thật 0,706 0,95 0,83 Hoạt tính (FU/ml) 0,68 6,15 0,236 Cảm ứng sau 25h Thử không 0,579 0,792 0,832 Thử thật 0,627 1,029 0,853 Hoạt tính (FU/ml) 1,13 5,6 0,497 Qua bảng 3.1 có nhận xét sau:
- Hoạt độ phân hủy fibrin cao hơn khoảng 10 lần ở chủng tái tổ hợp có cảm ứng (6,15 FU/ml) so với chủng hoang dại (0,68 FU/ml) sau 3 giờ cảm ứng ;
- Sau 25 giờ cảm ứng, hoạt tính phân hủy fibrin của chủng tái tổ hợp không giảm nhiều (5,6 FU/ml), điều này chứng tỏ hoạt tính tương đối ổn định; và cao gấp 5 lần so với chủng hoang dại (1,13 FU/ml).
- Chủng mang plasmid chưa chèn gen có hoạt độ thấp hơn chủng hoang dại 3 lần. Điều này cho thấy phù hợp vì chủng không có mang gen mã hóa enzym phân hủy fibrin.
Bảng 3.1. So sánh hoạt độ phân hủy fibrin của dịch ngoại bào ở các chủng Bacillus (4 lần thử thật và 3 lần thử không)
Chương 4
KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ
- 88 -
4.1. KẾT LUẬN
Với các kết quả thực nghiệm thu được đã trình bày ở phần trên, chúng tôi có các kết luận như sau:
- Phân lập nhiều chủng Bacillus từ Natto thương mại làm nguồn cho thu nhận gen mã hóa thích hợp cho Nattokinase.
- Thiết lập thành công hai hệ thống vector biểu hiện mang gen mã hóa Nattokinase nhân bản được trong E. coli và hoạt độngở Bacillus subtilis gồm hệ thống vector cho phép sáp nhập casset biểu hiện vào bộ gen (pAX01-aprE ) và hệ thống vector tồn tại độc lập đối với tế bào (pBG01-aprE).
- Biểu hiện và tiết vượt mức Nattokinase tái tổ hợp ở chủng Bacillus được loại bỏ các serine protease quan trọng; Là cơ sở thuận lợi cho khâu tinh chế và thu nhận Nattokinase sạch, không tạp nhiễm các serine protease có hoạt tính subtilisin. - Nattokinase tái tổ hợp sơ bộ được chứng minh có hoạt tính phân hủy fibrin gấp 5-
10 lần so với chủng tự nhiên sau 3 giờ cảm ứng và hoạt tính bền trong suốt thời gian nhân nuôi 25 giờ.