- Cho 100l dịch enzym vào 300l đệm Tris-HCl 0,1M (pH 7,8) chứa 10mM CaCl2. - Để ổn định trong 5 phút ở 30oC.
- Thêm 300l fibrin 1,2% (0,12g fibrin hòa trong Tris-HCl 0,1M, để tủ ấm) đối với mẫu thử thật.
- Để phản ứng trong 30 phút ở 30oC. - Bất hoạt enzym bằng 600l TCA 0,2M. - Thêm 300l fibrin 1,2% vào mẫu thử không.
- Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 5 phút. Thu dịch nổi. - Đo độ hấp thu ở bước sóng 280nm.
Hoạt tính enzym: Một đơn vị hoạt tính fibrinolytic được định nghĩa là lượng enzym làm tăng độ hấp thu ở bước sóng 280nm tạo 1g tyrosine trong 1 phút ở 30oC.
Hoạt tính enzym (FU/ml) = 0,0141 100 1000 ) 0 1 ( xtx xDx A A
Trong đó: A0 - độ hấp thu của mẫu thử không A1- độ hấp thu của mẫu thử thật
T - thời gian phản ứng (phút)
0,0141 - đỉnh hấp thu của tyrosine ở đường cong chuẩn D - độ pha loãng
1000 - hệ số chuyển đổi từ l sang ml 100 - thể tích enzym tham gia phản ứng
Chương 3
KẾT QUẢ
- 56 -
3.1. PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC CHỦNG BACILLUS SUBTILIS NATTO TỪ SẢN PHẨM NATTO
Theo nghiên cứu của AKIO và cộng sự (2000), các chủng Bacillus sp. được sử dụng làm Natto ngày nay được phân lập từ các mẫu thực vật (rơm rạ, cây thông kim, cây sồi lá) và từ đất. Ngoài hoạt tính phân hủy mạnh fibrin, các chủng Bacillus subtilis natto còn tạo tính dẻo dính tốt (sticky filament), có mùi thơm đặc trưng và ít sản sinh ammonia trong sản phẩm đậu tương sẽ được chọn lọc và sử dụng trong lên men sản xuất Natto thương mại.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi quan tâm đến nguồn gen mã hóa enzym Nattokinase có hoạt tính phân hủy fibrin mạnh ở các chủng Bacillus subtilis natto có nguồn gốc từ thực phẩm và an toàn khi sử dụng trong dược phẩm và thực phẩm chức năng. Vì vậy, các mẫu Natto khá phổ biến tại các siêu thị Nhật bản được chọn làm nguồn phân lập chủng và thu nhận gen mã hóa Nattokinase.
Tuy nhiên, ngày nay ở Nhật bản, Bacillus subtilis natto được khái niệm là chủng
Bacillus có khả năng lên men tốt và được dùng trong thực phẩm. Thực tế có rất nhiều chủng loại rất tương cận với B. natto như các chủng thuộc loài B. subtilis, B. cereus, B. megaterium, B. mycoides... Tuy nhiên, các chủng này khi sử dụng lên men đậu tương lại không cho đặc tính điển hình của Natto như tính dẻo và mùi vị. Hơn nữa, B. subtilis natto
chỉ phát triển được trong môi trường có biotin, nhưng các chủng loại B. subtilis khác không cần nhân tố này cho tăng trưởng (Watanabe et al. 1971). Thực tế này cho thấy rằng chủng phân lập từ Natto có thể rất đa dạng nhưng không phải tất cả đều là B. subtilis natto. Vậy, trong nghiên cứu này, khả năng phân hủy fibrin và nguồn gen mã hóa Nattokinase cần được nhận diện như các thông tin đã công bố.
Trước tiên, sản phẩm đậu tương lên men Natto được thử hoạt tính phân hủy fibrin trên đĩa thạch máu (Hình 3.1). Thực tế có 4 mẫu Natto thử nghiệm đều có khả năng phân hủy fibrin. Các mẫu này được sử dụng làm nguồn phân lập chủng Bacillus subtilis natto.
- 57 -
Từ 4 mẫu Natto nói trên chúng tôi có thể phân lập được 20 chủng có khuẩn lạc điển hình của Bacillus trên môi trường LB. Hình thái khuẩn lạc của các chủng phân lập được rất đa dạng (Hình 3.2). Hoạt tính phân hủy fibrin người của dịch chiết sau 48 giờ nuôi cấy
Bacillus sp. phân lập được thử nghiệm thể hiện trên Hình 3.3.
Vậy kết quả đạt được ở nội dung này là đã sàng lọc được các chủng Bacillus từ mẫu thực phẩm Natto có hoạt tính phân hủy fibrin mạnh làm đối tượng dự tuyển phân tích gen mã hóa.
a b
Hình 3.1. Sản phẩm Natto dùng phân lập được thử nghiệm hoạt tính sơ bộ
a) sản phẩm Natto; b) thử nghiệm hoạt tính sản phẩm
C1
- 58 -
Hình 3.2. Các dạng khuẩn lạc Bacillus phân lập được từ sản phẩm Natto
C4 C1
D2 D1
- 59 -