Biểu hiện gen aprE bằng hệ thống pAX01 trong Bacillus subtilis

a) Bacillus subtilis 1012

Hoạt hóa tế bào Bacillus subtilis 1012 mang plasmid tái tổ hợp pAX01-aprE trong môi trường LB-Ery100, lắc qua đêm ở 37oC, 250 vòng/phút. Cấy 500l chủng đã hoạt hóa sang một erlen chứa 10ml môi trường LB nuôi cấy lắc ở 37oC, 250 vòng/phút, trong 1,5-2 giờ để đạt OD578 khoảng 0,6 – 0.8. Sau đó bổ sung xylose vào môi trường trên sao cho nồng độ cuối là 0,5%, tiếp tục nuôi cấy lắc ở 250 vòng/phút, 37oC. Cứ sau 1 giờ, tiến hành ly tâm thu dịch lên men. Xử lý mẫu với dung dịch nạp mẫu 5X cho điện di SDS-PAGE. Phân tích sự biểu hiện của protein tái tổ hợp AprE bằng SDS-PAGE.

b) Bacillus subtilis DB104

Quy trình cảm ứng biểu hiện gen aprE gồm các bước sau:

- Hoạt hóa chủng B. subtilis DB104 mang plasmid tái tổ hợp pAX01-aprE trong 5 ml môi trường LB-Ery1, lắc qua đêm ở 37oC, 250 vòng/phút.

- Chuyển 600l chủng đã hoạt hóa sang erlen 250ml chứa 30ml môi trường LB, nuôi cấy lắc ở 37oC, 250 vòng/phút, trong khoảng 3 giờ để đạt OD578 khoảng 0,6 – 0.8.

- Sau đó bổ sung xylose vào môi trường nuôi cấy sao cho nồng độ cuối là 0,5%, tiếp tục nuôi cấy lắc ở 250 vòng/phút, 37oC. Lấy 10ml dịch nuôi cấy tại các thời điểm 0 giờ, 1,5 giờ và 3 giờ cảm ứng xylose.

- Ly tâm lạnh dịch nuôi cấy ở các thời điểm cảm ứng trên trong 10 phút thu tế bào và dịch nổi. Xử lý mẫu tế bào và mẫu dịch nổi như sau:

+ Mẫu tế bào: Cho enzym lysozym vào ủ ở 37oC trong 30 phút, sau đó bổ sung dung dịch TE và vortex hỗn hợp. Xử lý với dung dịch nạp mẫu 5X cho điện di SDS- PAGE.

+ Mẫu dịch nổi: Tủa bằng TCA 10% để lạnh đông qua đêm. Rã đông, tiến hành ly tâm lạnh ở 13.000 vòng/phút trong 10 phút bỏ dịch nổi, thu tủa. Rửa tủa bằng ethanol 90% lạnh và ethanol 70% lạnh. Phơi khô mẫu và hòa lại trong dung dịch Tris 1M. Xử lý với dung dịch nạp mẫu 5X cho điện di SDS-PAGE.

- Phân tích sự biểu hiện của protein tái tổ hợp AprE bằng SDS-PAGE.