Nattokinase
Nattokinase là một prepro-enzyme với 29 acid amin đầu N là peptide tín hiệu, 77 acid amin kế là tiền peptide, và 275 acid amin trưởng thành có trọng lượng phân tử khoảng 27,7 KDa. Các nghiên cứu trước đây cho thấy các gen mã hóa Subtilisin từ các chủng loại
Bacillus thường khác biệt khoảng 30 nucleotide trong tổng số khoảng 1146bp. Trong đó, sự da dạng này chủ yếu phân bố ở đầu C – trình tự mã hóa enzym trưởng thành. Nattokinase và Subtilisin E khác khoảng 13 nucleotide và 2 acid amin (Hình 3.8). Vì Nattokinase là một serine protease, các vị trí bảo tồn tại trung tâm xúc tác liên quan khá chặt chẽ đến hoạt tính
Hình 3.7. Kết quả đại diện dòng tế bào E. coli DH5 có mang pB-aprE bằng enzym cắt hạn chế BamHI
1 kb 3 kb
1: Thang DNA 1kb; 2: Trạng thái tự nhiên của plasmid pB; 3: pB được mở
vòng bằng EcoRV; 4: pB-aprE được cắt bởi BamHI; 5: Sản phẩm PCR của
aprE.
1164 bp 1.5 kb
1 2 3 4 5
- 65 -
enzym (Serin-221, Histidin-64, Aspartic-32). Vậy việc thu nhận gen mã hóa Nattokinase từ chủng phân lập, giải trình tự, tập trung so sánh và đánh giá mức độ biến động tại các vị trí quan trọng là phương cách nhằm tuyển chọn được các nguồn gen tốt trong tái tổ hợp gen.
AQSVPYGISQIKAPALHSQGYTGSNVKVAVIDSGIDSSHPDLNVRGGASFVPAETNPYQDGSSHGTH VAGTIAALNNSIGVLGVAPSASLYAVKVLDSTGSGQYSWIINGIEWAISNNMDVINMSLGGPSTSTAL KTVVDKAVSSGIVVAAAAGNEGSSGSTSTVGYPAKYPSTIAVGAVNSSNQRASFSSVGSELDVMAP GVSIQSTLPGGTYGAYNGTSMATPHVAGAAALILSKHPTWTNAQVRDRLESTATYLGNSFYYGKGL INVQAAAQAAAAA
Hình 3.8. Trình tự peptidetrưởng thành gồm 275 amino acid ở Nattokinase
Alanin-86 và Valin-193 là vị trí phân biệt sai khác giữa Nattokinase và Subtilisin E (Serin- 86 và Alanin-193); các vị trí đặc trưng quan trọng khác của Nattokinase làAspartic-32, Histidin-64, Serin-221 (trung tâm xúc tác); Serin-125, Glycin-127( vị trí enzym gắn cơ chất); Threonin 220, methionin 222 (nhạy cảm với sự oxy hóa)
Sau khi kiểm tra các plasmid tái tổ hợp của các dòng được sàng lọc bằng phương pháp PCR và enzym cắt hạn chế, đoạn gen aprE của các chủng Bacillus sp. phân lập và dòng hóa ở pB được giải trình tự với cặp mồi T3/T7 ở hai đầu của đoạn gen có trên vùng MCS. Kết quả giải trình tự gen aprE từ 12chủng phân lập cho kết quả như sau:
10 mẫu có trình tự nucleotide sai khác 01 (tại vị trí 528) trên tổng số 1146 nucleotide của gen aprE; nhưng amino acid mã hóa là tương đồng 100% với Nattokinase (EMBL ACJ11220.1 hay AAC60424.1) (Hình 3.9). Vậy đây là 10 bản mẫu gen thích hợp sẽ được chọn cho cấu trúc hệ thống Nattokinase tái tổ hợp. Và chúng tôi chọn bản mẫu của chủng Bacillus subtilis natto D3 cho cấu trúc hệ thống Nattokinase tái tổ hợp ở nội dung tiếp theo.
01 mẫu khuyết cytosine tại vị trí 437 dẫn đến trình tự amino acid mã hóa bất tương đồng với Nattokinase và mã hóa nhiều codon ngừng phiên mã từ vị trí amino acid 148
- 66 -
codon quan trọng tại vi trí 298 (vị trí 193 đối với peptide trưởng thành) là alanin thay vì valin đối với Nattokinase. Vậy đây là trình tự aprE đặc thù ở Bacillus subtilis nhưng không phải Bacillus subtilis natto(Hình 3.11a và 3.11b).
MRSKKLWISLLFALTLIFTMAFSNMSAQAAGKSSTEKKYIVGFKQTMSAMSSAKKKDVISEKGG KVQKQFKYVNAAAATLDEKAVKELKKDPSVAYVEEDHIAHEYAQSVPYGISQIKAPALHSQGYT GSNVKVAVIDSGIDSSHLT*TSEAEQASFLLKQTHTRTAVLTVRMSPVRLPLLITQSVFWA*RQAH HYMQ*KCLIQQEAANIAGLLTALSGPFPTIWMLST*ALADLLVLQR*KQ*LIKRFPAVSSLLPQPET KVHPEAQAQSATLQNILLLLQ*VR*TAATKELHSPA*VLSLM*WLLACPSKAHFLEALTALITERP WRLLTLPEQQR*FFLSTRLGQTRKSVIV*KALQHILETLSTMEKG*STYKQLHNNNS
Hinh 3.9. So sánh một phần trình tự nucleotide gen aprE của chủng phân lập với trình tự chuẩn
- 67 -
Hình 3.11a. Trình tự gen aprE của chủng B2 cho thấy có sự khác biệt 10 nucleotide so với aprE công bố
- 68 -
Hình 3.11b. Một phần trình tự mã hóa gen aprE của chủng B2 được so sánh với Nattokinase cho thấy khác biệt ở vị trí quan trọng Valin 298 (tương ứng vị trí 193 ở
peptide trưởng thành)
Vậy, cách tiếp cận sàng lọc nguồn gen từ chủng phân lập từ sản phẩm lên men bản địa (Nhật Bản) cho thấy cơ hội chọn được gen thích hợp; và qua việc phân tích trình tự gen, chúng tôi đã chọn được bản mẫu thích hợp làm nguồn thu nhận gen cho thiết lập hệ thống tái tổ hợp.
3.3. DÒNG HÓA GEN aprE VÀO CÁC VECTOR ĐƯỢC CẤU TRÚC CHO BIỂU HIỆN Ở BACILLUS
Để tạo các dòng tế bào Bacillus subtilis có mang vector biểu hiện nhằm thu nhận enzym mục tiêu Nattokinase, chúng tôi thử nghiệm các hệ thống biểu hiện là vector pAX01 và pBG01. Nhằm tạo vector biểu hiện tái tổ hợp, các vector và đoạn gen aprE được xử lý bằng cùng loại enzym cắt hạn chế để tạo đầu dính. Các bước tạo dòng gen aprE vào các chủng tế bào Bacillus subtilis được mô tả ở Hình 3.12 và Hình 3.16.