Các chủng Bacillus subtilis mang gen aprE tái tổ hợp được tiến hành nuôi cấy trong môi trường thành phần gồm (g/l): glucose 1, cao nấm men 10, K2HPO4 1 và MgSO4 0.5, pH môi trường 7-7,2. Để kiểm tra sự biểu hiện và tiết Nattokinase tái tổ hợp chúng tôi tiến hành nuôi cấy lắc chủng Bacillus này khi giá trị OD578nm đạt khoảng 0,6 – 0,8 tiến hành bổ sung
Hình 3.24. Kết quả kiểm tra sự dòng hóa aprE bằng PCR với bản mẫu là các plasmid tái tổ hợp, cặp mồi aprE-F/pMTL-R
- 81 -
0,5% xylose (cảm ứng biểu hiện gen mã hóa Nattokinase). Cứ sau 60 phút tiến hành thu nhận dịch lên men, ly tâm thu dịch nổi và tủa với ethanol tỷ lệ (1:4). Tiến hành chạy điện di SDS-PAGE.
3.5.1.1. Bacillus subtilis 1012
Chủng Bacillus subtilis 1012 là chủng chủ chưa loại bỏ gen aprE trong bộ gen. Thực nghiệm này nhằm chứng minh sự biểu hiện vượt mức hệ thống tái tổ hợp Nattokinase ở chủng hoang dại. Kết quả điện di protein phân đoạn tủa dịch ngoại bào (Hình 3.25) cho thấy đậm độ protein có kích thước phân tử 27.5 kDa (kích thước của Nattokinase) sau thời gian cảm ứng 3 giờ rõ nhất ở trường hợp chủng có chèn casset biểu hiện. Điều này chứng tỏ enzym Nattokinase tái tổ hợp đã được biểu hiện và tiết ra bên ngoài tế bào.
Vậy hệ thống tái tổ hợp Nattokinase được cấu trúc, biểu hiện và tiết thành công ở chủng B. subtilis 1012 hoang dại. Tuy nhiên, kết quả này chỉ nhằm đánh giá sơ bộ khả năng hoạt động của hệ thống. Mục tiêu chính cần đạt là sự biểu hiện Nattokinase ở chủng chủ đã được loại bỏ các serine protease tương cận với Subtilisin (về trọng lượng phân tử và chỉ số
Hình 3.25. Phân tích Nattokinase tái tổ hợp ngoại bào từ 5 ml dịch môi trường sau nuôi cấy
B. subtilis 1012 [pAX01-aprE], chủng được
chèn hệ thống cảm ứng biểu hiện Nattokinase;
B. subtilis 1012, chủng chưa chèn casset biểu
hiện NAT 25 KDa 1012 pAX01 Sau 3 gi 1012 Sau 3 gi
- 82 - tổ hợp ở khâu sau.
3.5.1.2. Bacillus subtilis DB104
Chủng Bacillus subtilis DB104 là chủng được loại bỏ các serine protease quan trọng như: AprE, NprE… Thực nghiệm cho thấy chủng này có hoạt tính phân giải protein thấp và hiệu quả tiết protein ngọai bào cao nên được tuyển chọn cho thử nghiệm làm chủng chủ biểu hiện.
Tương tự, chủng B. subtilis DB104 chèn casset lacA::Pxyl mang gen aprE được tiến hành nuôi cấy trong 30ml môi trường LB và cảm ứng bởi xylose 0,5% . Sự biểu hiện và tiết Nattokinase tái tổ hợp được kiểm tra bằng quy trình thu nhận dịch ngoại bào, tủa enzym sơ bộ và phân tích điện di protein (Hình 3.26).
Hình 3.26. Phân tích Nattokinase tái tổ hợp ngoại bào từ 2,5 ml dịch môi trường nuôi cấy chủng B. subtilis DB104 ở trường hợp kiểm soát bởi Pxyl
a) Dịch ngoại bào
1: Thang protein; 2,4,6: B. subtilis DB104[pAX01-aprE] không cảm ứng xylose;
3,5,7: B. subtilis DB104 [pAX01-aprE] được cảm ứng xylose.
b) Nội bào
1,3: B. subtilis DB104 [pAX01-aprE] không cảm ứng; 2,4: B. subtilis DB104 [pAX01-aprE] được cảm ứng xylose; 5: Thang protein.
b 31 kDa a 0h 1.5h 3h 1.5h 3h 31 kDa 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5
- 83 -
Kết quả phân tích sự biểu hiện ở chủng B. subtilis DB104 không cho phép phân biệt trường hợp có cảm ứng và không cảm ứng. Kết quả này được lý giải có lẽ do hệ thống kiểm soát biểu hiện bởi promoter xylA chưa đủ mạnh; casset biểu hiện do cấu trúc gắn chèn bộ gen Bacillus nên chỉ có 1 bản sao; chủng B. subtilis DB104 là chủng đột biến loại bỏ vài protease quan trọng nên khả năng tăng trưởng có phần hạn chế.
3.5.2. Kiểm tra sự biểu hiện của gen aprE dưới sự kiểm soát của Pgrac
Hệ thống vector pBG01 là vector tồn tại độc lập trong chủng B. subtilis. Gen aprE
được kiểm soát bởi promoter PSgrac, là promoter mạnh và nhạy cảm với lượng IPTG nồng độ thấp. Hệ thống biểu hiện này được thiết lập nhằm khắc phục những hạn chế của hệ thống vector pAX01 và Pxyl.
Chủng B. subtilis DB104mang plasmid tái tổ hợp pBG01-aprE được tiến hành nuôi cấy trong 30ml môi trường LB và nuôi cấy lắc chủng này khi giá trị OD578nm đạt khoảng 0,6 – 0,8 và cảm ứng bằng IPTG. Việc kiểm tra sự biểu hiện và tiết Nattokinase tái tổ hợp được tiến hành như đề cập ở mục 3.5.1.
Kết quả biểu hiện ngoại bào Nattokinase được thể hiện qua Hình 3.27. Giếng 3 và 6 xuất hiện vạch protein biểu hiện vượt mức với kích thước 27.5 kDa tương ứng với kích thước Nattokinase và hàm lượng protein mục tiêu tăng theo thời gian cảm ứng. Trong khi đó, ở các trường hợp đối chứng không chèn gen hoặc không được cảm ứng thì lượng protein tại vị trí tương ứng không đáng kể. Vậy, mặc dù hệ thống biểu hiện được thiết kế trên một plasmid nhân bản độc lập với bộ gen Bacillus nhưng hệ thống cảm ứng biểu hiện bởi PSgrac rất hiệu quả và được kiểm soát tương đối chặt chẽ ở Bacillus subtilis.
- 84 -
Kết quả phân tích phân đoạn protein nội bào ở Hình 3.28 cho thấy Nattokinase tái tổ hợp nội bào không đáng kể so với các trường hợp đối chứng không chèn gen mã hóa và không cảm ứng. Vậy Nattokinase tái tổ hợp được biểu hiện vượt mức đã được tiết ngoại bào hiệu quả.
Hình 3.27. Phân tích Nattokinase tái tổ hợp ngoại bào từ 2,5 ml môi trường nuôi cấy chủng B. subtilis DB104 ở trường hợp kiểm soát bởi PSgrac
Giếng 1: Thang protein
Giếng 2,5: B. subtilis DB104 mang pBG01 được cảm ứng IPTG
Giếng 3,6: B. subtilis DB104 mang pBG01-aprE được cảm ứng IPTG
Giếng 4,7: B. subtilis DB104 mang pBG01-aprE không được cảm ứng
21.5 kDa 1 2 3 4 5 6 7 31 kDa 1.5h NAT 3h
- 85 -
3.6. KIỂM TRA HOẠT TÍNH ENZYM NATTOKINASE TÁI TỔ HỢP
3.6.1. Kiểm tra hoạt tính sơ bộ
Mô hình làm tan fibrin người trên đĩa thạch bởi dịch ngoại bào sau nuôi cấy B. subtilis DB104 mang pBG01-aprE được thể hiện ở Hình 3.29. Trường hợp chủng mang gen
aprE tái tổ hợp được cảm ứng với IPTG có vòng tan fibrin đáng kể tại giếng 5 và 8 (sau 1,5 giờ cảm ứng) và làm tan fibrin mạnh hơn tại giếng 6 và 9 (sau 3 giờ cảm ứng). Trường hợp
Hình 3.28. Phân tích Nattokinase tái tổ hợp nội bào ở Bacillus subtilis DB104 ở trường hợp kiểm soát bởi PSgrac
Giếng 7: Thang protein
Giếng 1,4: B. subtilis DB104 mang pBG01 được cảm ứng IPTG
Giếng 2,5: B. subtilis DB104 mang pBG01-aprE không được cảm ứng
IPTG
Giếng 3,6: B. subtilis DB104 mang pBG01-aprE được cảm ứng IPTG
1 2 3 4 5 6 7
31 kDA
- 86 -
được cảm ứng (giếng 4 và 7) thì hoạt tính làm tan fibrin không được quan sát rõ.
Hình 3.29. Kết quả thử khả năng phân giải fibrin của dịch ngoại bào ở chủng B. subtilis DB104 mang pBG01-aprE được cảm ứng IPTG sau 2 giờ ủ
1, 2,3: B. subtilis DB104 mang pBG01 được cảm ứng IPTG; 4,7: B. subtilis DB104 mang pBG01-aprE không cảm ứng IPTG
5 và 8: B. subtilis DB104 mang pBG01-aprE sau 1,5 giờ cảm ứng IPTG 6 và 9: B. subtilis DB104 mang pBG01-aprE sau 3 giờ cảm ứng IPTG
3.6.2. Xác định hoạt độ phân hủy fibrin
Hoạt độ phân hủy fibrin (FU/ml) của dịch ngoại bào sau nuôi cấy được xác định theo phương pháp trình bày ở mục 2.2.18. Các trường hợp được so sánh là chủng DB104 mang pBG01-aprE, chủng mang plasmid chưa chèn gen (chủng DB104 pBG01) và B. subtilis natto (chủng hoang dại phân lập từ Natto). Các chủng được nuôi cấy lỏng trong môi trường LB và cảm ứng bằng IPTG ngoại trừ chủng hoang dại. Tiến hành thu mẫu tại thời
1 2 3 4 5 6 7 8 9
- 87 -
điểm 3 giờ và 25 giờ sau cảm ứng, ly tâm và thu dịch nổi cho xác định đơn vị hoạt tính. Kết quả thể hiện ở Bảng 3.1.
Thời gian Giá trị trung bình B. subtilis natto B. subtilis DB104- pBG01-aprE B. subtilis DB104-pBG01 Cảm ứng sau 3h Thử không 0,677 0,69 0,82 Thử thật 0,706 0,95 0,83 Hoạt tính (FU/ml) 0,68 6,15 0,236 Cảm ứng sau 25h Thử không 0,579 0,792 0,832 Thử thật 0,627 1,029 0,853 Hoạt tính (FU/ml) 1,13 5,6 0,497 Qua bảng 3.1 có nhận xét sau:
- Hoạt độ phân hủy fibrin cao hơn khoảng 10 lần ở chủng tái tổ hợp có cảm ứng (6,15 FU/ml) so với chủng hoang dại (0,68 FU/ml) sau 3 giờ cảm ứng ;
- Sau 25 giờ cảm ứng, hoạt tính phân hủy fibrin của chủng tái tổ hợp không giảm nhiều (5,6 FU/ml), điều này chứng tỏ hoạt tính tương đối ổn định; và cao gấp 5 lần so với chủng hoang dại (1,13 FU/ml).
- Chủng mang plasmid chưa chèn gen có hoạt độ thấp hơn chủng hoang dại 3 lần. Điều này cho thấy phù hợp vì chủng không có mang gen mã hóa enzym phân hủy fibrin.
Bảng 3.1. So sánh hoạt độ phân hủy fibrin của dịch ngoại bào ở các chủng Bacillus (4 lần thử thật và 3 lần thử không)
Chương 4
KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ
- 88 -
4.1. KẾT LUẬN
Với các kết quả thực nghiệm thu được đã trình bày ở phần trên, chúng tôi có các kết luận như sau:
- Phân lập nhiều chủng Bacillus từ Natto thương mại làm nguồn cho thu nhận gen mã hóa thích hợp cho Nattokinase.
- Thiết lập thành công hai hệ thống vector biểu hiện mang gen mã hóa Nattokinase nhân bản được trong E. coli và hoạt độngở Bacillus subtilis gồm hệ thống vector cho phép sáp nhập casset biểu hiện vào bộ gen (pAX01-aprE ) và hệ thống vector tồn tại độc lập đối với tế bào (pBG01-aprE).
- Biểu hiện và tiết vượt mức Nattokinase tái tổ hợp ở chủng Bacillus được loại bỏ các serine protease quan trọng; Là cơ sở thuận lợi cho khâu tinh chế và thu nhận Nattokinase sạch, không tạp nhiễm các serine protease có hoạt tính subtilisin. - Nattokinase tái tổ hợp sơ bộ được chứng minh có hoạt tính phân hủy fibrin gấp 5-
10 lần so với chủng tự nhiên sau 3 giờ cảm ứng và hoạt tính bền trong suốt thời gian nhân nuôi 25 giờ.
4.2. ĐỀ NGHỊ
Những thành công trong sàng lọc chủng, phân lập gen mã hóa thích hợp, cấu trúc các hệ thống và chủng biểu hiện Nattokinase có hoạt tính cao đã mở ra cơ hội cho triển khai các nghiên cứu sinh hóa học trong thu nhận và nhân nuôi bán công nghiệp phục vụ thực tiễn sản xuất.
TÀI LIỆU
- 89 -
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
[1] Lê Văn Nam và Lê Thị Cẩm Dung (2003), Điều trị chống huyết khối trong tai biến
mạch máu não, Tạp chí Y học TP.HCM, tập 7, phụ bản số 1, tr 14-19.
[2] Nguyễn Đình Giậu, Nguyễn Chi Mai, Trần Thị Việt Hồng (2000), Sinh lý học người và động vật, NXB- Đại học Quốc Gia thành phố Hồ Chí Minh, tr. 28- 33.
[3] Nguyễn La Anh, Đặng Thu Hương (2009), Nghiên cứu tách chiết enzym fibrinase từ
chủng B. subtilis NT5 và ứng dụng làm thực phẩm chức năng. Chương trình hội thảo. Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội.
[4] Nguyễn Quỳnh Anh (2006), Thiết lập các vector tự sao chép cho mục đích biểu hiện
protein tái tổ hợp trong Bacillus subtilis, Luận văn thạc sĩ, tr20-33.
[5] Nguyễn Thị Thảo, Quyền Đình Thi (2008), Nhân dòng, phân tích trình tự và biểu hiện
gen mã hóa Subtilisin từ các chủng B. subtilis G1 và RD23 trong E. coli BL21/pESUb. Hội nghị Khoa học, Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Quy Nhơn. [6] Phan Thị Thùy Hoa, Trần Hoàng Thái Dương, Huỳnh Phước Hạnh (2009), Tài liệu
khóa học huyết học- đông máu, Bộ y tế- Bệnh viện trung ương Huế- khoa Huyết học. [7] Trần Linh Thước (2002), Thực tập Kỹ thuật di truyền I, Khoa Sinh, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
[8] Chen P., et al. (2007), Strategy to approach stable production of recombinant Nattokinase in Bacillus subtilis, Biotechnol. Prog, 23, 808-813
[9] Chen P., et al. (2007), Medium optimization for the production of recombinant nattokinase by Bacillus subtilis using response surface methodology, Biotechnol Prog. 23 (6): 1327-1332
- 90 -
characterization of Nattokinase from Bacillus subtilis natto B-12, Journal of Agricultural and Food Chemistry, vol 57, issue 20, pp. 9722–9729.
[11] Choi N., et al. (2004), Cloning, expression, and fibrinolytic properties of a subtilisin DJ-4 gene from Bacillus sp. DJ-4., FEMS Microbiology Letters, 236, 325–331.
[12] Deepak V., Kalishwaralal K., Ramkumarpandian S., Babu S. Venkatesh, Senthilkumar S., Sangiliyandi G. (2008), Optimization of media composition for Nattokinase production by Bacillus subtilis using response surface methodology.
Bioresource Technology vol. 99 issue 17. p. 8170-8174.
[13] Deepak V., Pandian S., Kalishwaralal K, Gurunathan S. (2009), Purification, immobilization, and characterization of nattokinase on PHB nanoparticles. Bioresour Technol.;100(24): 6644-6. Epub 2009 Jul 15.
[14] Ehrlich S., Bruand C., Sozhamannan S., Dabert P., Gros M.F., Janniere L., Gruss A. (1991), Plasmid replication and structural stability in Bacillus subtilis, Res. Microbiol. 142, pp. 869–873.
[15] Hartl B., et al. (2001), Development of a new intergration site within the Bacillus subtilis chromosome and construction of compatible expression cassettes, J. Bacteriol., Vol. 183, No 8, pp: 2696-2699
[16] James L., Holly M. (2007), Fibrinolytic Dysfunction, Your Life Your Health, Part V. [17] Jau-Kai Wang*, Hua-Hsien Chiu, Ching-Shieh Hsieh (2009), Optimization of the medium components by statistical experimental methods to enhance Nattokinase activity,
Fooyin J Health Sci; 1(1):21−27
[18] Lagodich A., Cherva E., Shtaniuk Ya. V., Prokulevich V., Fomichev Yu. K., Prozorov A., Titok M. (2005), Construction of a vector system for molecular cloning in Bacillus subtilis and Escherichiacoli, Molecular Biology, Vol. 39, No 2, pp. 306–309. [19] Liang X., et al. (2007), Secretory expression of a heterologous nattokinase in Lactococcus lactis, Appl Microbiol Biotechnol. 75 (1): 95-101
[20] Liang X., et al. (2007), Secretory expression of nattokinase from Bacillus subtilis YF38 in Escherichia coli. Mol biotech. 37(3):187-94.
- 91 -
[21] Liu J., Xing J., Chang T., Liu H. (2006), Purification of Nattokinase by reverse micelles extraction from fermentation broth: effect of temperature and phase volume ratio, Bioprocess and Biosystems Engineering vol. 28 issue 4. P. 267 – 273.
[22] Martin Milner, Kouhei Makise (2002), Natto and its active ingredient nattokinase: A potent and safe thrombolytic agent, Alternative and Complementary Therapies, vol 8 issue 3, pp.157–194.
[23] Mei Zhi Weng, Zhong Liang Zheng, Wei Bao, Yong Jun Cai, Yan Yin, Gou Lin Zou (2009), Enhancement of oxidative stability of the subtilisin nattokinase by site-directed mutagenesis expressed in Escherichia coli, Biochimica et Biophysica Acta 1794, 1566– 1572
[24] Mogk A, Hayward R, Schumann W. (1996), Integrative vector for constructing single-copy transcriptional fusion between Bacillus subtilis promoters and reporter genes encoding heat-stable enzymes, Gene 182, pp. 33 36.
[25] Mohammad B., Hossein M., Mohammad R. (2009), Production and purification of streptokinase by protected affinity chromatography, Avicenna Journal of Medical Biotechnology, Vol. 1, No. 1,p. 47-51.
[26] Nguyen Q.A (2010), Development of Bacillus subtilis spores and cells for surface display of protein. Doctor dissertation, Bayreuth University, Germany. P. 47.
[27] Sorensen H., Mortensen K. (2005), Soluble expression of recombinant proteins in the cytoplasma of Escherichia coli, Microb cell Fact 4, 1.
[28] Sui-Lam Wong, Ruiqiong Ye và Shyrose Nathoo (1994), Engineering and production of streptokinase in a Bacillus subtilis expression-secretion system, Applied and Enviromental microbiology. P. 517-523
[29] Titok M., Chapuis J., Selezneva Y., Lagodich A., Prokulevich V., Ehrlich S., Janniere L. (2003), Bacillus subtilis soil isolates: Plasmid replicon analysis and construction of a new theta-replicatingvector, Plasmid 49, pp. 53-62.
[30] Wahlström E., Vitikainen M., Kontinen V.P., Sarvas M. (2003), The extracytoplasmic folding factor PrsA is required for protein secrection only in the presence of the cell wall in Bacillus subtilis, Microbiology, 149, 569-577.
- 92 -
Bacillus subtilis natto B-12, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 57, 9722–9729 [32] Weng M., et al. (2009), Enhancement of oxidative stability of the subtilisin nattokinase by site-directed mutagenesis expressed in Escherichia coli, Biochim Biophys Acta.; 1794(11):1566-72.
[33] Wong S. (1995), Advances in the use of Bacillus subtilis for the expression and secretion of heterologousp proteins, Curr.Opin. Biotechnol. 6, pp. 517–522.
[34] Xiaoyan Zu, Zhenya Zhang, YingnanYang, Haitao Che, Guihua Zhang, Ji Li (2010),
Thrombolytic activities of Nattokinase extracted from Bacillus subtilis fermented soybean curd residues, International Journal of Biology Vol. 2, No. 2, pp. 120 – 125.
[35] Xu-Chu Wu, Shi-Chung Ng, Richard I. and Sui-Lam Wong. (1993), Efficient production of a functional single – chain antidigoxin antibody via an engineered Bacillus subtilis expression-secretion system, Nature Biotech. 11,71 – 76.
TÀI LIỆU INTERNET
[36] http://en.hasanderma.com/cardiovascular/8-phong-ngua-benh-huyet-khoi-do-xo- vua-dong-mach.html [37] http://www.chauphuthinh.com/news_detail.php?id=20 [38] http://www.tin247.com/tp_hcm_9000_nguoi_chet_moi_nam_vi_tai_bien_mach_mau_na o-10-164157.html [39] http://huanluyenvientaigia.com/news/c90/nguyen-nhan-gay-ra-dot-quy-210.html [40] http://dieutrihoc.blogspot.com/2009/05/chong-ong.html [41] http://www.mobitec.de/int/products/bio/04_vector_sys/index.php?bac_sub.html [42] http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/P35835.1