Thu nhận plasmid bằng phương pháp SDS kiềm

Quy trình tách chiết plasmid pAX01 từ E. coli DH5 bao gồm các bước sau:

- Cấy chuyền chủng E. coli mang plasmid sang 5ml LB lỏng có bổ sung kháng sinh ampicillin ở nồng độ 100g/ml, lắc qua đêm ở 37oC.

- Ly tâm thu sinh khối tế bào ở 10.000 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt độ phòng. 95oC 1 phút 45giây 72oC 72oC 3,5 phút 15 phút 30 chu kỳ 5phút 95oC

Hình 2.3. Chương trình PCR thu nhận gen aprE

- Hút bỏ phần dịch, bổ sung 100l dung dịch I, vortex mạnh để phá màng. Thêm 200l dung dịch II, đảo nhẹ vài lần. Thêm 150l dung dịch III lạnh, đảo nhẹ thật kĩ và ủ trong đá 15 phút.

- Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC . Chuyển dịch nổi sang một eppendorf mới, bổ sung 1l RNase 10mg/ml, đảo nhe. Ủ hỗn hợp ở 37oC trong 1 giờ 30 phút.

- Bổ sung 500l hỗn hợp phenol: chloroform (1v:1v), đảo nhẹ nhiều lần. Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC. Hút nhẹ nhàng dịch nổi sang một eppendorf mới.

- Bổ sung 500l chloroform, đảo nhẹ nhiều lần. Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút. Hút nhẹ nhàng dịch nổi sang một eppendorf mới.

- Thêm sodium acetat 3M với tỉ lệ là 1/10 thể tích mẫu và bổ sung ethanol 99% lạnh với tỉ lệ là 2,5 thể tích mẫu. Ử ở 4oC khoảng 30 phút, sau đó ly tâm 13.000 vòng/phút trong 30 phút ở 4oC, thu tủa.

- Rửa tủa bằng 500l ethanol 70% lạnh, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC. Thu tủa, để tủa khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng.

- Hòa tan tủa trong 50l nước cất vô trùng và giữ ở -20oC. - Điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết trên gel agarose 1%.