Một trong những hệ thống dòng hóa cho biểu hiện đầu tiên trong nội dung nghiên cứu biểu hiện gen tái tổ hợp là hệ thống vector sát nhập, pAX01. pAX01 là vector dùng dòng hóa gen ở E. coli và có thể sát nhập đoạn chèn vào bộ gen Bacillus subtilis tại locus
lacA bằng phép trao đổi đồng dạng. Cấu trúc phần chèn là một casset có thể kiểm soát sự biểu hiện gồm promoter xylA và gen mã hóa cho 1 repressor XylR. Vậy, sự biểu hiện gen bởi promoter xylA được kiểm soát âm bởi XylR và được giải ức chế khi có sự hiện diện của xylose. Hệ thống này đã được chứng minh được kiểm soát tốt và mạnh hơn hệ thống operator lac gấp 4 lần.
- 69 -
Chủng E. coli mang plasmid pAX01 được cung cấp bởi nhóm tác giả cấu trúc nên plasmid [Kim et al., 1996]. Chúng tôi tiến hành nuôi cấy, tách chiết plasmid pAX01 theo phương pháp SDS-kiềm và kiểm tra plasmid bằng enzym cắt hạn chế. Thu nhận đúng plasmid với hàm lượng thích hợp phục vụ cho các công đoạn dòng hóa.
Hình 3.12. Sơ đồ các bước tạo dòng gen aprE vào hệ thống pAX01 trong Bacillus subtilis 1012, DB104
- 70 -
Sản phẩm plasmid pAX01 và gen aprE được xử lý bằng enzym cắt hạn chế BamHI và SacII. Tỉ lệ enzym cắt sử dụng theo hướng dẫn của nhà sản xuất (Fermentas). Sản phẩm cắt plasmid và gen aprE được tinh chế bằng bộ kit Column Purification PCR product (Fermentas) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Nồng độ plasmid và gen thu nhận được sau tinh chế lần lượt đạt khoảng 80ng/µl và 150ng/µl. Như vậy, plasmid và gen mã hóa được tinh chế là đủ lượng để thực hiện phản ứng nối. Gen aprE được nối vào plasmid pAX01 tại vị trí BamHI và SacII.
Sau khi thực hiện phản ứng nối tạo plasmid pAX01- aprE, sản phẩm nối được biến nạp vào vật chủ E. coli DH5. Chủng biến nạp sẽ được trải trên đĩa môi trường LB-Amp100 và ủ ở 370C trong 12 – 14 giờ. Dòng tế bào mang plasmid sẽ trở nên kháng với ampicilin và mọc được trên môi trường có kháng sinh nhờ gen mã hóa bla trên khung plasmid (Hình 3.13).
Kết quả nối được kiểm soát qua kết quả PCR khuẩn lạc, phân tích plasmid bằng enzym cắt hạn chế và giải trình tự gen mã hóa bằng mồi bắt cặp bổ sung với vùng thượng
Hình 3.13. Kết quả dòng hóa ở E. coli DH5
a) chứng âm: E.coli được biến nạp bằng plasmid đã xử lý BamHI/SacII
dùng trong phản ứng nối; b) sản phẩm nối pAX01- aprE
- 71 -
nguồn vị trí chèn gen là lacA locustrên khung plasmid. Kết quả PCR khuẩn lạc và phân tích plasmid lần lượt được thể hiện trên Hình 3.14 và Hình 3.15.
Hình 3.14. Kết quả kiểm tra sự dòng hóa aprE bằng PCR khuẩn lạc, cặp mồi pAX01-F/aprE-R-SacII
Kết quả cắt hoàn toàn pAX01 bằng EcoRV cho 3 phân đoạn gen có kích thước lần lượt 1503 bp, 2118 bp và 4160 bp. Trong khi đó, kết quả xử lý EcoRV plasmid tái tổ hợp pAX01- aprE cho kích thước phân biệt là 1503 bp, 3282 bp và 4160 bp.
2
3000 bp
Hình 3.15. Plasmid tái tổ hợp cắt với EcoRV
Giếng 1: Thang chuẩn DNA 1kb Giếng 2: plasmid pAX01-aprE cắt với
EcoRV
Giếng 3: trạng thái tự nhiên của
plasmid pAX01-aprE 1164 bp 1503 bp 3282 bp 4160 bp 1000 bp 1500 bp 4000 bp 1 2 3
- 72 -