Nattokinase trong vector pBluescript II KS (+), kí hiệu pB
Đoạn gen aprE được dòng hóa vào vector pB theo chiến lược tạo dòng đầu bằng. Sản phẩm tái tổ hợp được biến nạp vào tế bào E. coli DH5 nhằm lưu trữ plasmid tái tổ hợp in vivo. Các bước thực hiện như sau:
- Cắt mở vòng plasmid pB bằng EcoRV.
- Tinh chế sản phẩm cắt bằng bộ kít tinh chế DNA.
- Đoạn DNA của gen mã hóa cho enzym Nattokinase được nối vào plasmid pB đã chuẩn bị ở trên để tạo plasmid tái tổ hợp.
- Hóa biến nạp hỗn hợp dịch nối vào tế bào khả nạp E. coli DH5
- Trải hỗn hợp hóa biến nạp lên môi trường LB-Amp100 có bổ sung X-gal. - Chọn khuẩn lạc màu trắng làm khuẩn lạc dự tuyển.
- Thực hiện phản ứng PCR khuẩn lạc với cặp mồi T3, T7, khuôn DNA là tế bào E. coli DH5 từ khuẩn lạc màu trắng mọc trên môi trường LB-Amp100.
- Chọn khuẩn lạc cho kết quả phản ứng PCR dương tính. Khuẩn lạc này được dùng làm khuôn cho phản ứng PCR khuẩn lạc với cặp mồi aprE-F-BamHI /aprE-R-
SacII.
- Chọn những khuẩn lạc cho kết quả PCR dương tính với đoạn gen aprE để tách chiết plasmid và cắt kiểm tra plasmid bằng enzym BamHI.
- Sản phẩm sau khi cắt được phân tích trên gel agarose 1% cùng với thang DNA chuẩn để kiểm tra.
- Giải trình tự gen aprE trong plasmid tái tổ hợp và kiểm tra độ tương đồng của trình tự gen aprE với các trình tự aprE của Bacillus subtilis natto có trên ngân hàng gen bằng phần mềm Jellyfish. - Thành phần Thể tích sử dụng Buffer Red 10X 5l pB (tinh chế qua cột) l Enzym EcoRV l Tổng thể tích 50l
Sau khi thực hiện phản ứng cắt plasmid pB bằng EcoRV, sản phẩm cắt tiếp tục được tinh chế qua cột. Sau đó chạy điện di để kiểm tra nồng độ của sản phẩm pB-EcoRV và gen
aprE và đặt phản ứng nối pB với aprE với thể tích đoạn chèn-insert (gen aprE) và vector pB được tính theo công thức sau:
ng vector x (kb kích thước insert/kb kích thước vector) x (tỷ lệ insert/vector)
Tính toán dựa vào công thức trên, cuối cùng ta có được thành phần phản ứng nối như Bảng 2.6.
Thành phần Thể tích sử dụng
Buffer T4-DNA ligase 10X l
pBlue/EcoRV(100ng/l) 2,5l
sp PCR aprE (100ng/l) l
Enzym T4-ligase (10U) l
PEG 5% l
ddH2O Đủ 2l
Phản ứng nối trên để ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ, hết thời gian ủ thêm 0,5l enzym
EcoRV cho một phản ứng và ủ sản phẩm ở 37oC trong 1 giờ. Sau đó, sản phẩm nối được hóa biến nạp vào tế bào khả nạp E. coli DH5
Thành phần Thể tích sử dụng Buffer BamHI 10X l Plasmid pB-aprE l Enzym BamHI l ddH2O l Tổng thể tích 20l
2.2.8. Tạo dòng tế bào E. coli DH5 tái tổ hợp mang gen mã hóa cho protein Nattokinase trong hệ thống vector pAX01 Nattokinase trong hệ thống vector pAX01
Gen aprE được nối với plasmid pAX01 tại vị trí enzym cắt hạn chế BamHI và
SacII, và biến nạp vào E. coli bằng hóa biến nạp. Các dòng E. coli mang vector có gen chèn được sàng lọc bằng nuôi cấy trên môi trường LB có ampicillin 100µg/ml và bằng phản ứng PCR khuẩn lạc với mồi xuôi thiết kế trên khung plasmid pAX01 và mồi ngược là trình tự bắt
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng nối pB và aprE (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
cặp bổ sung với đầu 3’ gen aprE. Dòng E. coli chọn lọc được tách chiết thu nhận plasmid, kiểm tra cấu trúc plasmid bằng enzym cắt hạn chế EcoRV. Gen mã hóa được giải trình tự và phân tích sự đa dạng.
Đoạn gen aprE được dòng hóa vào plasmid pAX01 theo chiến lược tạo dòng đầu so le. Sản phẩm tái tổ hợp được biến nạp vào tế bào E. coli DH5Các bước thực hiện như sau: - Plasmid pAX01 sau khi tách chiết và kiểm tra bằng điện di sẽ được cắt bằng hai
enzym BamHI và SacII không đồng thời cùng lúc.
- Đoạn gen aprE sau khi tinh sạch cũng sẽ được cắt bằng hai enzym BamHI và
SacII không đồng thời cùng lúc.
- Nối đoạn gen aprE và plasmid pAX01 đã cắt ở trên với nhau và sản phẩm nối được hóa biến nạp vào tế bào khả nạp E. coli DH5.
- Trải tế bào trên môi trường LB-Amp100, ủ ở 37oC qua đêm. Chọn các khuẩn lạc có mọc trên môi trường LB-Amp100.
- Thực hiện phản ứng PCR khuẩn lạc với khuôn DNA là tế bào E. coli mọc được trên môi trường LB-Amp100 với cặp mồi aprE-F-BamHI và aprE-R-SacII. Những khuẩn lạc cho kết quả phản ứng PCR dương tính với đoạn gen aprE được cấy vào môi trường lỏng LB-Amp100 để thực hiện tách chiết plasmid.
- Thực hiện phản ứng PCR với khuôn là plasmid được tách chiết từ các khuẩn lạc dự tuyển với cặp mồi xuôi trên khung plasmid và mồi ngược trên gen mã hóa. - Các plasmid có phản ứng PCR cho sản phẩm khuếch đại tương ứng kích thước dự
đoán sẽ được cắt bằng enzym BamHI/SacII.
- Điện di sản phẩm cắt trên gel agarose 1% với thang DNA 1kb chuẩn để kiểm tra lại kích thước của plasmid và đoạn gen aprE.
Thành phần Thể tích sử dụng Thể tích sử dụng Buffer BamHI 10X 10l 10l pAX01 (1537,7ng/l) 50l x aprE (500ng/l) x 55l Enzym BamHI 10l l dH2O 30l l Tổng thể tích 100l 100l
Ủ hỗn hợp cắt bằng BamHI ở 37oC trong 2 giờ. Sau đó, tinh chế sản phẩm cắt qua cột tinh chế và tiếp tục cắt bằng enzym thứ hai là SacII, ủ ở 37oC trong 6 giờ.
Thành phần Thể tích sử dụng Thể tích sử dụng Buffer Blue 10X 10l 10l pAX01/BamHI (336,3ng/l) l x aprE/BamHI (85,8ng/l) x 72l Enzym SacII 8l 18l dH2O l l Tổng thể tích 100l 100l
Sau đó, tiếp tục tinh chế sản phẩm cắt plasmid và gen aprE bằng SacII qua cột và thực hiện phản ứng nối, ủ qua đêm ở 22oC.
Thành phần Thể tích sử dụng
Buffer T4 ligase 5X l
pAX01/BamHI+SacII (110ng/l) 6l aprE/BamHI+SacII (143,8ng/l) 15l
Bảng 2.8. Thành phần phản ứng cắt plasmid pAX01 và gen aprE bằng BamHI
Bảng 2.9. Thành phần phản ứng cắt plasmid pAX01 và gen aprE bằng SacII
Enzym ligase l
Tổng thể tích 30l
Sau đó, sản phẩm nối được hóa biến nạp vào tế bào khả nạp E. coli DH5.
2.2.9. Tạo dòng tế bào E. coli DH5 tái tổ hợp mang gen mã hóa cho protein Nattokinase trong hệ thống vector pBG01 Nattokinase trong hệ thống vector pBG01
Gen aprE được nối với plasmid pBG01 tại vị trí enzym cắt hạn chế BamHI và XbaI, và biến nạp vào E. coli bằng hóa biến nạp. Các dòng E. coli mang vector có gen chèn được sàng lọc bằng nuôi cấy trên môi trường LB có ampicillin 100µg/ml và bằng phản ứng PCR khuẩn lạc với mồi xuôi là trình tự bắt cặp bổ sung với đầu 5’ gen aprE và mồi ngược được thiết kế trên khung plasmid pBG01 là pMTL-R. Dòng E. coli chọn lọc được tách chiết thu nhận plasmid, kiểm tra cấu trúc plasmid bằng enzym cắt hạn chế EcoRI.
Đoạn gen aprE được dòng hóa vào plasmid pBG01 theo chiến lược tạo dòng đầu so le. Sản phẩm tái tổ hợp được biến nạp vào tế bào E. coli DH5. Các bước thực hiện như sau: - Plasmid pBG01 sau khi tách chiết và kiểm tra bằng điện di sẽ được cắt bằng hai
enzym BamHI và XbaI đồng thời cùng lúc.
- Đoạn gen aprE sau khi tinh sạch cũng sẽ được cắt bằng hai enzym BamHI và
XbaI đồng thời cùng lúc.
- Nối đoạn gen aprE và plasmid pBG01 đã cắt ở trên với nhau và sản phẩm nối được hóa biến nạp vào tế bào khả nạp E. coli DH5. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Trải tế bào trên môi trường LB-Amp100, ủ ở 37oC qua đêm. Chọn các khuẩn lạc có mọc trên môi trường LB-Amp100.
- Thực hiện phản ứng PCR khuẩn lạc với khuôn DNA là tế bào E. coli mọc được trên môi trường LB-Amp100 với cặp mồi aprE-F-BamHI và pMTL-R. Những khuẩn lạc cho kết quả phản ứng PCR dương tính với đoạn gen aprE được cấy vào môi trường lỏng LB-Amp100 để thực hiện tách chiết plasmid.
- Thực hiện phản ứng PCR với khuôn là plasmid được tách chiết từ các khuẩn lạc dự tuyển với cặp mồi xuôi trên gen mã hóa và mồi ngược trên khung plasmid.
- Các plasmid có phản ứng PCR cho sản phẩm khuếch đại tương ứng kích thước dự đoán sẽ được cắt bằng enzym BamHI/XbaI.
- Điện di sản phẩm cắt trên gel agarose 1% với thang DNA 1kb chuẩn để kiểm tra lại kích thước của plasmid và đoạn gen aprE.
Thành phần Thể tích sử dụng Thể tích sử dụng
Buffer TangoTM 10X 5l 5l
Plasmid pBG01 5l x
Gen aprE x 7,5
Enzym BamHI (10U/l) 1l 1l
Enzym XbaI (10U/l) 1l 1l
dH2O Đủ 50l Đủ 50l
Ủ hỗn hợp cắt trên ở 37oC trong 3 giờ. Sau đó, tinh chế sản phẩm cắt qua cột tinh chế.
Thành phần Thể tích sử dụng
Buffer T4 DNA ligase 5X l
pBG01/BamHI+XbaI l
aprE/BamHI+XbaI 5l
Enzym T4 DNA ligase (4U/l) l
dH2O Đủ 20l
Phản ứng nối được giữ ở 22oC trong 4 giờ. Sau đó, sản phẩm nối được hóa biến nạp vào tế bào khả nạp E. coli DH5.
Bảng 2.11. Thành phần phản ứng cắt plasmid pBG01 và gen aprE bằng BamHI và XbaI