bào khả nạp B. subtilis
Hai chủng Bacillus subtilis được sử dụng làm tế bào khả nạp và biểu hiện gen là B. subtilis 1012, B. subtilis DB104.
a) Chuẩn bị tế bào khả nạp Bacillus subtilis
- Nuôi cấy lắc chủng Bacillus subtilis trong ống nghiệm 5ml môi trường LB qua đêm.
- Chuyển 1ml dịch nuôi cấy qua đêm vào 50ml môi trường HS (tỉ lệ 1/50 hoặc 1/20), nuôi cấy lắc ở 37oC với tốc độ 250 vòng/phút trong khoảng 3 – 5h để giá trị OD578 đạt khoảng từ 2.5 – 3.
- Khi OD578 đạt giá trị từ 2.5 – 3, lấy 10ml dịch nuôi cấy cho vào erlen 100ml vô trùng mỗi 30 phút. Sau đó bổ sung 1ml glycerol 99% lạnh, giữ trong đá lạnh trong thời gian 30 phút.
- Chuyển nhanh dịch nuôi cấy vào các eppendorf 1,5ml (1ml/eppendorf) và bảo quản ở -20oC.
b) Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả nạp B. subtilis
- Lấy một eppendorf chứa tế bào khả nạp B. subtilis đã chuẩn bị sẵn ở trên để ở nhiệt độ phòng hoặc 37oC cho rả đông.
- Chuyển tế bào khả nạp trong eppendorf vào một ống nghiệm lớn vô trùng. Thêm vào ống nghiệm 10ml môi trường LS (tỉ lệ 1/10) và lắc ở tốc độ 80 vòng/phút trong 2 giờ ở 30oC.
- Sau đó dùng pipetman hút 1ml dịch nuôi cấy cho vào eppendorf mới vô trùng và bổ sung 100l EGTA nồng độ 0,1M, pH 7,2 lọc, không hấp. Để yên ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.
- Tiếp tục bổ sung DNA tái tổ hợp (0,5-2g) vào eppendorf và nuôi cấy lắc với tốc độ 250 vòng/phút ở 37oC trong 2 giờ.
- Ly tâm thu sinh khối với tốc độ 4.000 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt độ phòng. - Hút bỏ 0,9ml dịch nổi và huyền phù tế bào trong 0,1ml dịch nổi còn lại. Sau đó đem trãi trên môi trường có kháng sinh chọn lọc.
2.2.13. Tạo dòng tế bào Bacillus subtilis có mang plasmid biểu hiện pAX01 chứa
gen aprE, viết tắt là pAX01-aprE a) Bacillus subtilis 1012
Chủng Bacillus subtilis 1012 lacA::spec là chủng mang cassette lacA::spec - là cassette chứa locus lacA mang gen mã hóa cho enzym -galactosidase tương ứng với vùng
lacA trên plasmid pAX01 và mang gen kháng kháng sinh spectinomycine. Plasmid pAX01- PxylA-aprE có vị trí tương đồng tại locus lacA trên bộ gen Bacillus subtilis. Khi plasmid được biến nạp vào tế bào Bacillus subtilis, sẽ xảy ra sự trao đổi chéo kép đồng dạng tại vùng
thượng và hạ nguồn gen lacA trên bộ gen và kết quả là casset biểu hiện aprE được sát nhập vào bộ gen Bacillus subtilis. Phần chèn của plasmid có mang đoạn gen kháng kháng sinh erythromycin nên thể biến nạp có khả năng kháng và phát triển được trên đĩa môi trường kháng sinh này. Hơn nữa, việc trao đổi đồng dạng này còn dẫn đến sự thay thế gen kháng spectinomycin vốn đã được cấu trúc sẵn tại locus lacA của chủng chủ Bacillus. Do vậy, thể biến nạp sẽ trở nên nhạy cảm với spectinomycin nếu trao đổi đúng vị trí.
Quá trình tạo dòng gồm các bước như sau:
- Tách plasmid tái tổ hợp pAX01-aprE từ dòng tế bào E. coli DH5 đã tạo dòng thành công.
- Biến nạp plasmid đã tách vào tế bào khả nạp Bacillus subtilis 1012 lacA:spec. Lúc này ta được tế bào B. subtilis 1012 đã biến đổi mang gen kháng kháng sinh erythromycin.
- Trải tế bào trên môi trường LB có bổ sung kháng sinh chọn lọc là erythromycin nồng độ 100g/ml, ủ ở 37oC qua đêm.
- Tiến hành đồng thời trải tế bào trên môi trường LB có bổ sung kháng sinh spectinomycin nồng độ 100g/ml làm chứng âm.
- Quan sát và đọc kết quả.
b) Bacillus subtilis DB104
Chủng Bacillus subtilis DB104 là chủng đã được loại bỏ các gen mã hóa các protease có hoạt tính phân hủy fibrin không mong muốn. Do vậy chủng này được sử dụng làm chủng chủ trong biểu hiện Nattokinase tái tổ hợp là một trong những phương cách giúp dễ dàng kiểm soát hoạt tính thô của enzym trong suốt quá trình lên men. Quá trình tạo dòng chủng B. subtilis DB104 mang plasmid tái tổ hợp pAX01-aprE gồm các bước như sau:
Quá trình tạo dòng gồm các bước như sau:
- Tách plasmid tái tổ hợp pAX01-aprE từ dòng tế bào E. coli DH5 đã tạo dòng thành công.
- Biến nạp plasmid đã tách vào tế bào khả nạp Bacillus subtilis DB104. Lúc này ta được tế bào B. subtilis DB104 đã biến đổi mang gen kháng kháng sinh erythromycin.
- Trải tế bào trên môi trường LB có bổ sung kháng sinh chọn lọc là erythromycin nồng độ 100g/ml, ủ ở 37oC qua đêm.
- Quan sát và chọn các khuẩn lạc có mọc trên môi trường LB-Ery100. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Thực hiện phản ứng PCR khuẩn lạc với khuôn DNA là tế bào B. subtilis DB104 mọc được trên môi trường LB-Ery100 với cặp mồi là mồi xuôi trên khung plasmid pAX01-F-seq và mồi ngược trên gen aprE-R-SacII. Những khuẩn lạc cho kết quả phản ứng PCR dương tính với đoạn gen aprE được cấy vào môi trường lỏng LB-Ery1 để thực hiện tách chiết bộ gen.
- Thực hiện phản ứng PCR với khuôn là bộ gen được tách chiết từ các khuẩn lạc dự tuyển với cặp mồi xuôi và ngược như trên.
- Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% với thang DNA 1kb để đọc kết quả.
2.2.14. Tạo dòng tế bào Bacillus subtilis DB104 có mang plasmid biểu hiện pBG01 chứa gen aprE, viết tắt là pBG01-aprE
Quá trình tạo dòng gồm các bước như sau:
- Tách plasmid tái tổ hợp pBG01-aprE từ dòng tế bào E. coli DH5 đã tạo dòng thành công.
- Biến nạp plasmid đã tách vào tế bào khả nạp Bacillus subtilis DB104. Lúc này ta được tế bào B. subtilis DB104 đã biến đổi mang gen kháng kháng sinh chloramphenicol.
- Trải tế bào trên môi trường LB có bổ sung kháng sinh chọn lọc là chloramphenicol nồng độ 10g/ml, ủ ở 37oC qua đêm.
- Quan sát và chọn các khuẩn lạc có mọc trên môi trường LB-Cm10.
- Thực hiện phản ứng PCR khuẩn lạc với khuôn DNA là tế bào B. subtilis DB104 mọc được trên môi trường LB-Cm10 với cặp mồi là mồi xuôi trên gen aprE-F-
phản ứng PCR dương tính với đoạn gen aprE được cấy vào môi trường lỏng LB- Cm10 để thực hiện tách chiết plasmid.
- Thực hiện phản ứng PCR với khuôn là plasmid được tách chiết từ các khuẩn lạc dự tuyển với cặp mồi xuôi và ngược như trên.
- Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% với thang DNA 1kb để đọc kết quả.
2.2.15. Biểu hiện gen aprE bằng hệ thống pAX01 trong Bacillus subtilis a) Bacillus subtilis 1012 a) Bacillus subtilis 1012
Hoạt hóa tế bào Bacillus subtilis 1012 mang plasmid tái tổ hợp pAX01-aprE trong môi trường LB-Ery100, lắc qua đêm ở 37oC, 250 vòng/phút. Cấy 500l chủng đã hoạt hóa sang một erlen chứa 10ml môi trường LB nuôi cấy lắc ở 37oC, 250 vòng/phút, trong 1,5-2 giờ để đạt OD578 khoảng 0,6 – 0.8. Sau đó bổ sung xylose vào môi trường trên sao cho nồng độ cuối là 0,5%, tiếp tục nuôi cấy lắc ở 250 vòng/phút, 37oC. Cứ sau 1 giờ, tiến hành ly tâm thu dịch lên men. Xử lý mẫu với dung dịch nạp mẫu 5X cho điện di SDS-PAGE. Phân tích sự biểu hiện của protein tái tổ hợp AprE bằng SDS-PAGE.
b) Bacillus subtilis DB104
Quy trình cảm ứng biểu hiện gen aprE gồm các bước sau:
- Hoạt hóa chủng B. subtilis DB104 mang plasmid tái tổ hợp pAX01-aprE trong 5 ml môi trường LB-Ery1, lắc qua đêm ở 37oC, 250 vòng/phút.
- Chuyển 600l chủng đã hoạt hóa sang erlen 250ml chứa 30ml môi trường LB, nuôi cấy lắc ở 37oC, 250 vòng/phút, trong khoảng 3 giờ để đạt OD578 khoảng 0,6 – 0.8.
- Sau đó bổ sung xylose vào môi trường nuôi cấy sao cho nồng độ cuối là 0,5%, tiếp tục nuôi cấy lắc ở 250 vòng/phút, 37oC. Lấy 10ml dịch nuôi cấy tại các thời điểm 0 giờ, 1,5 giờ và 3 giờ cảm ứng xylose.
- Ly tâm lạnh dịch nuôi cấy ở các thời điểm cảm ứng trên trong 10 phút thu tế bào và dịch nổi. Xử lý mẫu tế bào và mẫu dịch nổi như sau:
+ Mẫu tế bào: Cho enzym lysozym vào ủ ở 37oC trong 30 phút, sau đó bổ sung dung dịch TE và vortex hỗn hợp. Xử lý với dung dịch nạp mẫu 5X cho điện di SDS- PAGE.
+ Mẫu dịch nổi: Tủa bằng TCA 10% để lạnh đông qua đêm. Rã đông, tiến hành ly tâm lạnh ở 13.000 vòng/phút trong 10 phút bỏ dịch nổi, thu tủa. Rửa tủa bằng ethanol 90% lạnh và ethanol 70% lạnh. Phơi khô mẫu và hòa lại trong dung dịch Tris 1M. Xử lý với dung dịch nạp mẫu 5X cho điện di SDS-PAGE.
- Phân tích sự biểu hiện của protein tái tổ hợp AprE bằng SDS-PAGE.
2.2.16. Biểu hiện gen aprE bằng hệ thống pBG01 trong Bacillus subtilis DB104
Tương tự như mục 2.2.15 b) nhưng hoạt hóa chủng B. subtilis DB104 mang plasmid tái tổ hợp pBG01-aprE trong 5 ml môi trường LB-Cm10 và cảm ứng bằng IPTG nồng độ cuối là 0,1mM.
2.2.17. Phân tích protein biểu hiện bằng SDS-PAGE
- Sau khi cho dung dịch nạp mẫu 5X vào mẫu đã xử lý, tiến hành đun cách thủy ở 100oC, trong 5 phút.
- Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút, thu dịch nổi.
- Tương ứng với mỗi giếng trên khuôn gel SDS-PAGE, nạp 10-12l mẫu có cảm ứng, 10l-12l mẫu không có cảm ứng làm mẫu chứng âm và 3l thang protein vào mỗi giếng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Chạy điện di ổn định dòng với cường độ 2mA/giếng mẫu.
- Lấy gel ra khỏi tấm kính, cắt bỏ phần gel gom, đánh dấu một góc của gel phân tích. - Nhuộm gel với dung dịch nhuộm ít nhất trong 4 giờ.
- Giải nhuộm bằng dung dịch giải nhuộm, thay dung dịch giải nhuộm đến khi nền gel trở nên trong suốt và vạch protein xuất hiện rõ.
- So sánh các vạch protein của mẫu với mẫu chứng âm, xác định vạch protein tái tổ hợp.
- So sánh vạch protein dung hợp với thang protein, xác định kích thước của protein tái tổ hợp.
2.2.18. Phương pháp xác định hoạt tính Nattokinase [17]
- Cho 100l dịch enzym vào 300l đệm Tris-HCl 0,1M (pH 7,8) chứa 10mM CaCl2. - Để ổn định trong 5 phút ở 30oC.
- Thêm 300l fibrin 1,2% (0,12g fibrin hòa trong Tris-HCl 0,1M, để tủ ấm) đối với mẫu thử thật.
- Để phản ứng trong 30 phút ở 30oC. - Bất hoạt enzym bằng 600l TCA 0,2M. - Thêm 300l fibrin 1,2% vào mẫu thử không.
- Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 5 phút. Thu dịch nổi. - Đo độ hấp thu ở bước sóng 280nm.
Hoạt tính enzym: Một đơn vị hoạt tính fibrinolytic được định nghĩa là lượng enzym làm tăng độ hấp thu ở bước sóng 280nm tạo 1g tyrosine trong 1 phút ở 30oC.
Hoạt tính enzym (FU/ml) = 0,0141 100 1000 ) 0 1 ( xtx xDx A A
Trong đó: A0 - độ hấp thu của mẫu thử không A1- độ hấp thu của mẫu thử thật
T - thời gian phản ứng (phút)
0,0141 - đỉnh hấp thu của tyrosine ở đường cong chuẩn D - độ pha loãng
1000 - hệ số chuyển đổi từ l sang ml 100 - thể tích enzym tham gia phản ứng
Chương 3
KẾT QUẢ
- 56 -
3.1. PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC CHỦNG BACILLUS SUBTILIS NATTO TỪ SẢN PHẨM NATTO
Theo nghiên cứu của AKIO và cộng sự (2000), các chủng Bacillus sp. được sử dụng làm Natto ngày nay được phân lập từ các mẫu thực vật (rơm rạ, cây thông kim, cây sồi lá) và từ đất. Ngoài hoạt tính phân hủy mạnh fibrin, các chủng Bacillus subtilis natto còn tạo tính dẻo dính tốt (sticky filament), có mùi thơm đặc trưng và ít sản sinh ammonia trong sản phẩm đậu tương sẽ được chọn lọc và sử dụng trong lên men sản xuất Natto thương mại.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi quan tâm đến nguồn gen mã hóa enzym Nattokinase có hoạt tính phân hủy fibrin mạnh ở các chủng Bacillus subtilis natto có nguồn gốc từ thực phẩm và an toàn khi sử dụng trong dược phẩm và thực phẩm chức năng. Vì vậy, các mẫu Natto khá phổ biến tại các siêu thị Nhật bản được chọn làm nguồn phân lập chủng và thu nhận gen mã hóa Nattokinase.
Tuy nhiên, ngày nay ở Nhật bản, Bacillus subtilis natto được khái niệm là chủng
Bacillus có khả năng lên men tốt và được dùng trong thực phẩm. Thực tế có rất nhiều chủng loại rất tương cận với B. natto như các chủng thuộc loài B. subtilis, B. cereus, B. megaterium, B. mycoides... Tuy nhiên, các chủng này khi sử dụng lên men đậu tương lại không cho đặc tính điển hình của Natto như tính dẻo và mùi vị. Hơn nữa, B. subtilis natto
chỉ phát triển được trong môi trường có biotin, nhưng các chủng loại B. subtilis khác không cần nhân tố này cho tăng trưởng (Watanabe et al. 1971). Thực tế này cho thấy rằng chủng phân lập từ Natto có thể rất đa dạng nhưng không phải tất cả đều là B. subtilis natto. Vậy, trong nghiên cứu này, khả năng phân hủy fibrin và nguồn gen mã hóa Nattokinase cần được nhận diện như các thông tin đã công bố.
Trước tiên, sản phẩm đậu tương lên men Natto được thử hoạt tính phân hủy fibrin trên đĩa thạch máu (Hình 3.1). Thực tế có 4 mẫu Natto thử nghiệm đều có khả năng phân hủy fibrin. Các mẫu này được sử dụng làm nguồn phân lập chủng Bacillus subtilis natto.
- 57 -
Từ 4 mẫu Natto nói trên chúng tôi có thể phân lập được 20 chủng có khuẩn lạc điển hình của Bacillus trên môi trường LB. Hình thái khuẩn lạc của các chủng phân lập được rất đa dạng (Hình 3.2). Hoạt tính phân hủy fibrin người của dịch chiết sau 48 giờ nuôi cấy
Bacillus sp. phân lập được thử nghiệm thể hiện trên Hình 3.3.
Vậy kết quả đạt được ở nội dung này là đã sàng lọc được các chủng Bacillus từ mẫu thực phẩm Natto có hoạt tính phân hủy fibrin mạnh làm đối tượng dự tuyển phân tích gen mã hóa. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
a b
Hình 3.1. Sản phẩm Natto dùng phân lập được thử nghiệm hoạt tính sơ bộ
a) sản phẩm Natto; b) thử nghiệm hoạt tính sản phẩm
C1
- 58 -
Hình 3.2. Các dạng khuẩn lạc Bacillus phân lập được từ sản phẩm Natto
C4 C1
D2 D1
- 59 -
3.2. PHÂN TÍCH ĐA DẠNG GEN MÃ HÓA SUBTILISIN VÀ CHỌN TRÌNH TỰ GEN MÃ HÓA ĐẠI DIỆN TỰ GEN MÃ HÓA ĐẠI DIỆN
3.2.1. Tách chiết DNA bộ gen Bacillus sp. phân lập từ Natto
Để cung cấp nguồn DNA sạch sử dụng nhân bản gen aprE, chúng tôi thực hiện tách chiết DNA bộ gen Bacillus sp. về cơ bản theo phương pháp của Marmur (1961) gồm các bước cơ bản: ly giải màng và phân cắt protein bằng enzym lyzozym và proteinase K, biến tính protein bằng hỗn hợp Phenol:Chloroform, và tủa DNA bộ gen bằng muối NaAcetat trong môi trường ethanol tuyệt đối lạnh.
Các chủng nuôi cấy ở giai đoạn giữa và cuối pha log được thu để tách DNA bộ gen. Từ 2 ml huyền phù nuôi cấy, chúng tôi đã thu nhận được khoảng 2µg/µl DNA với độ sạch tương đối về protein, muối và hợp chất hữu cơ (OD260/280 = 1,73; OD260/230 = 1,6)
(Hình 3.4). Như vậy, DNA bộ gen thu nhận được có thể sử dụng làm bản mẫu khuếch đại gen mã hóa Nattokinase bằng phương pháp PCR với bản mẫu từ 50-100ng.
Hình 3.3. Kết quả thử nghiệm nhanh hoạt tính phân hủy fibrin người ở các chủng phân lập sau 6 giờ ủ
- 60 -
3.2.2. Thu nhận gen mã hóa Nattokinase
Chúng tôi tham khảo trình tự gen mã hóa subtilisin Nattokinase (aprE) tại cơ sở dữ liệu bộ gen Bacillus subtilis (GenomeNet from the Bacillus subtilis research community in Japan) với mã số BG10190 và ngân hàng dữ liệu EMBL với mã số ACJ 11220.1. Cấu trúc gen aprE gồm phần mã hóa cho trình tự tiết (signal sequence), propeptide (đoạn peptide sẽ được cắt trong quá trình tiết), và protein trưởng thành. Trình tự amino acid của protein