Chuẩn bị tế bào khả nạp E coli DH5và hóa biến nạp sản phẩm nối vào tế

bào khả nạp E. coli DH5

a) Chuẩn bị tế bào khả nạp E. coli DH5

- Cấy một khuẩn lạc đơn E. coli DH5α vào 5ml môi trường LB lỏng, nuôi cấy lắc qua đêm ở 37oC.

- Cho 1ml dịch nuôi cấy trên vào 100ml môi trường LB lỏng, nuôi cấy lắc ở 37oC, tốc độ 250 vòng/phút cho đến khi giá trị OD600 của dịch nuôi cấy đạt 0,4- 0,5 (khoảng 3 giờ). - Ngâm erlen chứa dịch nuôi cấy vào đá lạnh trong 10 phút. Lắc nhẹ để làm lạnh đều môi trường.

- Cho dịch tế bào vào các ống ly tâm đã được làm lạnh sẵn và ly tâm thu sinh khối ở 6.000 vòng/phút, trong 3 phút, 4oC.

- Bỏ dịch nổi và huyền phù nhẹ nhàng trong 10ml CaCl2 0,1M lạnh 4oC. - Ủ trong đá lạnh, thời gian 20 phút.

- Sau đó ly tâm thu sinh khối ở 6.000 vòng/phút, trong 3 phút, 4oC.

- Bỏ dịch nổi, thu cặn tế bào và huyền phù lại trong 5ml dung dịch hỗn hợp 0,1M CaCl2 lạnh và glycerol 15% lạnh.

- Dịch huyền phù tế bào được chia vào các eppendorf 1,5ml vô trùng, lạnh (khoảng 200l/eppendorf) và giữ ở -20oC.

b) Hóa biến nạp sản phẩm nối vào tế bào khả nạp E. coli DH5

- Cho toàn bộ thể tích sản phẩm nối vào eppendorf tế bào khả nạp đã được chuẩn bị ở trên, để vào đá lạnh trong 30 phút.

- Sau đó cho sốc nhiệt ở 42oC trong 2 phút.

- Nhanh chóng chuyển mẫu vào đá lạnh, tiếp tục để trong 5 phút.

- Thêm 900l môi trường LB vào các ống eppendorf trên. Ủ ở 37oC trong 30 phút. - Ly tâm thu sinh khối ở 8.000 vòng/phút, thời gian 1 phút.

- Bỏ 900l dịch nổi, huyền phù khoảng 100l dịch còn lại và trải toàn bộ trên đĩa môi trường LB-Amp100, ủ ở 37oC trong 16-18 giờ.

- Tiến hành đồng thời hai mẫu đối chứng: đối chứng dương biến nạp 3l plasmid và đối chứng âm không có plasmid.