Hóa biến nạp 12 sản phẩm nối vào vi khuẩn E. coli DH5 và trải trên môi trường LB-Amp100 có bổ sung X-gal. Kết quả thu được các khuẩn lạc xanh và trắng. Các khuẩn lạc màu trắng được chọn làm các khuẩn lạc dự tuyển để sàng lọc dòng tế bào có mang plasmid chứa gen mục tiêu.
3.2.3.2. Sàng lọc dòng tế bào E. coli DH5 có mang plasmid chứa gen aprE bằng phương pháp PCR phương pháp PCR
Vì plasmid pB có chứa hai trình tự của promotor T3, T7 nằm ở hai phía của vùng MCS nên chúng tôi thực hiện phản ứng PCR khuẩn lạc với cặp mồi T3/T7 và DNA khuôn mẫu là một vài tế bào từ các khuẩn lạc trắng từ đĩa LB-Amp100-Xgal nhằm sàng lọc dòng tế bào có chứa plasmid tái tổ hợp. Sản phẩm khuếch đại bằng phương pháp PCR với cặp mồi T3/T7 có kết quả thể hiện ở Hình 3.5. Ở giếng 2, sản phẩm PCR của plasmid pB không chứa đoạn chèn aprE hiện một vạch có kích thước 160bp. Ở giếng 1 và 5, sản phẩm PCR của tế bào vi khuẩn từ khuẩn lạc màu trắng cho vạch có kích thước khoảng 1324bp. Điều này chứng tỏ tế bào đã có mang plasmid pB chứa gen aprE (pB-aprE). Tế bào cho kết quả
- 62 -
PCR khuẩn lạc dương tính (giếng 1) được chọn để tách chiết plasmid và được sử dụng làm DNA khuôn trong phản ứng PCR với cặp mồi chuyên biệt aprE-F-BamHI/aprE-R-SacII, kết quả điện di sản phẩm PCR cho một vạch có kích thước 1164bp (giếng 6) đúng với kích
thước của đoạn gen aprE (Hình 3.5).
Giếng 3 là sản phẩm của phản ứng PCR không có DNA khuôn mẫu được xem là chứng âm không thấy xuất hiện vạch, điều này chứng tỏ các cặp mồi sử dụng trong các phản ứng PCR sàng lọc dòng tế bào E. coli mang plasmid tái tổ hợp pB-aprE là chuyên biệt.
Hình 3.5. Kết quả sàng lọc dòng tế bào E. coli DH5 có mang pB-aprE bằng phản ứng PCR
Giếng 1, 5: Phản ứng PCR sử dụng pB-aprE làm khuôn, mồi T3/T7
Giếng 2: Phản ứng PCR sử dụng pB làm khuôn, mồi T3/T7
Giếng 3: Phản ứng PCR không sử dụng DNA khuôn (chứng âm), mồi T3/T7
Giếng 4: Thang DNA 1kb
Giếng 6: Phản ứng PCR sử dụng pB-aprE làm khuôn, mồi aprE-F- BamHI/aprE-R-SacII 1164 bp 1000 bp 160 bp 1324 bp 1324 bp 1 2 3 4 5 6
- 63 -
12 chủng E. coli DH5 mang plasmid tái tổ hợp của 12 gen mục tiêu aprE được kiểm tra kết quả sàng lọc một lần nữa bằng phản ứng PCR với bản mẫu là các plasmid tương ứng và cặp mồi T3/T7. Kết quả thể hiện ở Hình 3.6.