5.2.5.1 Nguyên tắc
Miễn dịch huỳnh quang là một kỹ thuật mà kháng thể cho gắn với một phân tử huỳnh quang (fluorochrome), kháng thể này đƣợc sử dụng để phát hiện sự tồn tại của kháng nguyên ở bên trong hoặc ở trên bề mặt của tế bào hoặc mô thông qua huỳnh quang đƣợc phát ra bởi kháng thể liên kết với nó khi đƣợc kích thích bởi ánh sáng thích hợp.
Hình 5.15: Nguyên lý của kính hiển vi huỳnh quang
Tùy thuộc vào phân tử huỳnh quang đƣợc gắn lên kháng thể liên kết đặc hiệu với kháng nguyên, hay kháng thể thứ 2 kháng kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên mà ta có miễn dịch huỳnh quang trực tiếp hoặc gián tiếp. Miễn dịch huỳnh quang gián tiếp thƣờng nhạy hơn miễn dịch huỳnh quang trực tiếp vì có sự khuếch đại tín hiệu và dễ dàng hơn trong khâu chuẩn bị kháng thể. Vì vậy trong thực tế miễn dịch huỳnh quang gián tiếp thƣờng đƣợc sử dụng hơn.
Miễn dịch huỳnh quang trực tiếp Miễn dịch huỳnh quang gián tiếp
5.2.5.2 Các phân tử huỳnh quang
Các phân tử huỳnh quang (còn gọi chất nhuộm huỳnh quang – fluorescence dye) là các hợp chất hóa học có khả năng hấp thụ năng lƣợng ánh sáng (photon) tại một vùng bƣớc sóng nhất định và phát ra ánh sáng có bƣớc sóng dài hơn (năng lƣợng thấp hơn). Bƣớc sóng hấp thụ cực đại (còn gọi là bƣớc sóng kích thích – excitation) và bƣớc sóng phát ra cực đại (emission) là những thông số quan trọng cần đƣợc chú ý của một phân tử huỳnh quang. Ngoài ra nồng độ của phân tử huỳnh quang trong dung dịch cũng nhƣ thành phần và pH môi trƣờng chứa phân tử huỳnh quang cũng rất quan trọng để cho hình ảnh tối ƣu, rõ nét và tránh các tín hiệu nền. Trong khi xem kết quả và chụp ảnh các phân tử huỳnh quang cần chú ý đặc biệt đến tuổi thọ (lifetime) của chúng, việc kích thích quá lâu các phân tử này có thể dẫn tới photobleaching hoặc photoresistance (mất tín hiệu huỳnh quang khi bị kích thích liên tục).
Lưu ý: Việc sử dụng 2 phân tử huỳnh quang khác nhau để nhuộm cho cùng một tế bào cần chú ý đặc biệt đến bƣớc sóng kích thích và bƣớc sóng phát ra của 2 phân tử này. Vì bƣớc sóng phát ra của phân tử này có thể là bƣớc sóng kích thích của phân tử huỳnh quang kia vì vậy sẽ tạo ra các tín hiệu giả. Tƣơng tự, với miễn dịch huỳnh quang gián tiếp cho 2 kháng thể thứ nhất khác nhau (nhận biết 2 kháng nguyên khác nhau trên cùng một tế bào) cần phải sử dụng 2 kháng thể thứ nhất khác loài (host) hoặc sử dụng các phƣơng pháp đặc biệt khác.
5.2.5.3 Flow cytometry
Flow cytometry thƣờng đƣợc sử trong phòng thí nghiệm để xác định và đếm số lƣợng tế bào mang kháng nguyên cần xác định. Tế bào đầu tiên đƣợc đánh dấu với các kháng thể mang phân tử huỳnh quang bằng phƣơng pháp miễn dịch huỳnh quang trực tiếp hoặc gián tiếp. Tế bào sau đó đƣợc phân tích trên máy Flow cytometry.
Trong máy này, các tế bào đƣợc bắn vào buồng chiếu tia lazer với kích thƣớc lỗ đủ nhỏ để cho một tế bào đi qua, vì vậy các tế bào đi vào buống chiếu tia lazer theo dòng tế bào (flow cell). Tại buồng này, các phân tử huỳnh quang gắn trên tế bào sẽ hấp thụ năng lƣợng từ ánh sáng tia lazer tại bƣớc sóng tƣơng ứng và ánh sáng huỳnh quang đƣợc phát ra từ tế bào có thể đƣợc đo bằng một hay nhiều loại detector khác nhau.
Hình 5.16: Nguyên tắc của Flow cytometry
Ứng dụng???
Tiểu luận: Các dạng biểu đồ và xử lý số liệu của Flow cytometry Tiểu luận: Các loại kính hiện vi huỳnh quang thông dụng