3.3.1 Định nghĩa kháng thể đơn dòng
Kháng thể phản ứng một cách đặc hiệu với kháng nguyên và các phân tử kích thích tạo ra nó vì vậy cung cấp một tác nhân hữu hiệu cho việc phát hiện các chất mong muốn. Nhƣ chúng ta đã biết, kháng thể đƣợc tạo ra bởi tế bào lympho B của cơ thể chủ khi bị kích thích bởi các phân tử lạ hoặc kháng nguyên. Mỗi dòng tế bào lympho B chỉ tạo một loại kháng thể để chống lại một epitope hoặc một vị trí trên phân tử lạ. Bởi vì có rất nhiều tế bào B trong cơ thể, huyết thanh của động vật đƣợc gây đáp ứng miễn dịch sẽ chứa một hỗn hợp các kháng thể đối với kháng nguyên.
Những kháng thể này đƣợc gọi là kháng thể đa dòng (polyclonal) bởi vì chúng chứa đa dạng các kháng thể nhận biết các vị trí khác nhau trên phân tử kháng nguyên. Cũng có thể tạo ra chỉ một dòng tế bào để sản xuất ra một lƣợng lớn các kháng thể đơn dòng (monoclonal, MAbs)) mà chỉ nhận biết một epitope của kháng nguyên cần biết.
Ngày nay, kháng thể đơn dòng đang đƣợc sử dụng ngày càng rộng rãi trong việc điều trị và phát hiện ung thƣ. Kháng thể đơn dòng đầu tiên đƣợc làm toàn bộ từ chuột. Một vấn đề rắc rối đối với kháng thể đơn dòng từ chuột là hệ thống miễn dịch của ngƣời sẽ nhận biết các kháng thể này nhƣ là chất lạ (vì chúng từ các loài khác nhau) và vì vậy sẽ gây ra đáp ứng để chống lại chúng. Phản ứng này thỉnh thoảng còn đƣợc gọi là dị ứng. Đối với một số kháng thể có thể không gây phản ứng sock ngay lập tức, và kháng thể sẽ có vai trò ở trong một thời gian ngắn, sau đó hệ thống miễn dịch của cơ thể sẽ tiêu diệt chúng trƣớc khi chúng có tác dụng.
Qua một thời gian, một vài nhà nghiên cứu đã tìm cách để thay thế một vài phần của kháng thể chuột bằng các phần của ngƣời. Các kháng thể này đƣợc gọi là kháng thể “chimeric” hoặc kháng thể đƣợc con ngƣời hóa (humanized antibodies).
Trong phần tiếp theo chúng ta sẽ học về nguyên tắc tạo kháng thể đơn dòng từ chuột.
3.3.2 Nguyên tắc sản xuất kháng thể đơn dòng
Năm 1975, Kohler và Milstein đã phát triển kỹ thuật sản xuất kháng thể đơn dòng trên chuột. Vì những ứng dụng to lớn của kháng thể đơn dòng mà hai tác giả đã đƣợc nhận giải Nobel y học vào năm 1984.
Bƣớc đầu tiên của sản xuất kháng thể đơn dòng đó là tạo ra các tế bào hybridoma, là các tế bào B có thể tạo ra một lƣợng lớn kháng thể, có tốc độ phân chia nhanh, và có tuổi thọ cao.
+ Tế bào này đƣợc tạo bằng cách gây miễn dịch cho chuột chống lại kháng nguyên mong muốn. Thông thƣờng, hàng loạt các đáp ứng miễn dịch diễn ra trong một vài tuần cho đến khi một kháng thể thích hợp chiếm ƣu thế trong đáp ứng miễn dịch. Phƣơng pháp tiêm vào màng bụng thƣờng đƣợc áp dụng để đƣa kháng nguyên vào cơ thể chuột.
+ Bƣớc tiếp theo là kiểm tra chuột có tạo đƣợc kháng thể chống lại kháng nguyên mong muốn hay không sau một thời gian đƣợc tiêm với kháng nguyên (thông thƣờng là 14 ngày sau khi tiêm) bằng cách kiểm tra sự có mặt của kháng thể trong huyết thanh chuột (thƣờng đƣợc lấy ở đuôi chuột). Các phƣơng pháp kiểm tra sự có mặt của kháng thể sẽ đƣợc trình bày ở chƣơng sau. Lƣu ý là trong khi một vài tế bào B sẽ tạo ra các kháng thể liên kết với epitope của kháng thể mong muốn, những tế bào B khác lại tạo ra các kháng thể không đặc hiệu mà không nhận biết đƣợc kháng nguyên đã tiêm. Chuột có chứa kháng thể mong muốn sẽ đƣợc tiêm kháng nguyên tăng cƣờng trƣớc khi tiến hành các bƣớc tiếp theo.
+ Lá lách từ các vật chủ có tạo ra các kháng thể mong muốn đƣợc đem đi phân tách thành các tế bào riêng rẻ trong môi trƣờng nuôi cấy để giải phóng các tế bào lympho B. Trong môi trƣờng nuôi cấy cũng chứa sẵn dòng tế bào u tủy (myeloma cell line) có nguồn gốc từ chuột. Đây là các tế bào khối u có thể phân chia không giới hạn nhƣng không có khả năng tạo ra kháng thể. Khi thêm poly ethylglycol (PEG) vào môi trƣờng nuôi cấy, chúng sẽ phá hỏng màng của một vài tế bào và vì vậy cho phép trộn lẫn vật liệu di truyền từ cả hai loại tế bào. Tế bào đƣợc hình thành từ việc dung hợp tế bào B và tế bào u tủ đƣợc gọi là hybridoma. Tế bào hybridoma này mang đặc tính của cả 2 loại tế bào lympho B và tế bào u, hay nói cách khác là dòng tế bào “bất tử” có khả năng tạo kháng thể.
+ Bƣớc tiếp theo là tách các tế bào hybridoma ra khỏi các tế bào B và tế bào khối u chƣa dung hợp. Tế bào B không dung hợp sẽ nhanh chóng bị chết sau một thời gian nuôi cấy do tuổi thọ các tế bào B ngắn, vấn đề còn lại chỉ là tách tế bào hybridoma và tế bào khối u chƣa dung hợp. Các tế bào khối u thiếu một enzyme là hypoxanthine-guanine-phosphoribosyl transferase (HGPRT), một enzyme quan trọng tham gia vào quá sinh tổng hợp DNA theo con đƣờng tái sử dụng các nucleic acid (salvage synthesis) từ các RNA hoặc DNA bị phân hủy. Trong điều kiện bình thƣờng, các tế bào này sẽ tự tổng hợp các nucleic acid để tham gia vào quá trình sản sinh DNA theo con đƣờng gọi là de novo purine synthesis. Tuy nhiên, nếu trong môi trƣờng nuôi cấy có chứa aminopterin sẽ ức chế con đƣờng de novo purine synthesis làm cho các tế bào này hoàn toàn không còn khả năng sinh tổng hợp nucleic acid mà phải phụ thuộc vào sự cung cấp từ môi trƣờng bên ngoài. Do đó, để tách tế bào dung hợp ra khỏi các tế bào khối u chƣa dung hợp, các tế bào này đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng lựa chọn HAT (vì nó có chứa hypoxanthine, aminopterin, and thymidine). Trong môi trƣờng này chỉ có các tế bào dung hợp là sống sót vì các tế bào lympho B sẽ bổ sung enzyme cho các tế bào khối u. Tóm lại, cá tế bào hybridoma tồn tại trong quá trình nuôi cấy vì nó mang khả năng sinh sản không hạn chế của tế bào khối u và đồng thời các tế bào này đƣợc bảo vệ khỏi môi trƣờng lựa chọn HAT vì nó có khả năng tổng hợp enzyme HGPRT của tế bào lympho B.
+ Mỗi dòng tế bào hybridoma sống sót sẽ đƣợc nuôi cấy trong một ô nuôi cấy. Các tế bào đƣợc mô tả nhƣ là nuôi cấy đơn dòng vì chúng đƣợc tăng sinh từ một tế bào đơn lẻ ban đầu và vì vậy chúng hoàn toàn giống nhau.
+ Sau khi đƣợc nuôi cấy trong một vài tuần để đủ số lƣợng tế bào, mỗi dòng tế bào đƣợc sàng lọc để tìm ra các dòng tế bào cho kháng thể mong muốn. Việc sàng lọc là bƣớc tốn kém nhất trong quá trình sản xuất kháng thể đơn dòng vì quá trình dung hợp có thể tạo ra hàng ngàn dòng tế bào hybridoma riêng rẻ. Quá trình nhận biết sự tạo kháng thể mong muốn trong môi trƣờng nuôi cấy cũng giống nhƣ sự nhận biết kháng thể trong huyết thanh chuột.
+ Cuối cùng các dòng tế bào hybridoma sản sinh kháng thể mong muốn đƣợc làm lạnh đông và đƣợc bảo quản trong nitơ lỏng. Các kháng thể mong muốn đƣợc tạo ra từ các dòng tế bào này và sau khi đƣợc tinh sạch ra khỏi dung dịch nuôi cấy đƣợc gọi là kháng thể đơn dòng.
CHƢƠNG 4
BỔ THỂ, CYTOKINE VÀ SỰ ĐIỀU HÒA MIỄN DỊCH 4.1 BỔ THỂ
4.1.1 Định nghĩa
Trƣớc đây, thuật ngữ bổ thể (Complement, C) đƣợc sử dụng để ám chỉ tới các thành phần của huyết thanh không bền với nhiệt (hoạt động của chúng bị ức chế bằng cách đun nóng huyết thanh ở 56oC khoảng 30 phút) mà có thể dung giải tế bào vi khuẩn. Tuy nhiên, hiện nay bổ thể còn đƣợc biết nhƣ một thành phần đóng góp vào cơ chế bảo vệ tế bào chủ theo nhiều cách khác nhau. Bổ thể có thể opsonin hóa tế bào vi khuẩn để kích thích quá trình thực bào; nó có thể phục hồi và hoạt hóa nhiều tế bào khác nhau bao gồm bạch cầu đa nhân và đại thực bào; nó có thể tham gia vào việc điều hòa đáp ứng kháng thể và nó có thể trợ giúp trong việc xóa bỏ phức hợp miễn dịch và các tế bào đã chết theo chƣơng trình lập sẵn. Bổ thể cũng có thể có những ảnh hƣởng bất lợi cho tế bào chủ; nó đóng góp vào sự gây viêm và sự phá hỏng mô, và nó có thể kích thích sự sock phản vệ.
Bổ thể bao gồm 20 loại protein khác nhau trong huyết thanh (một số tài liệu ghi là 30 protein) mà đƣợc tạo ra bởi nhiều loại tế bào bao gồm các tế bào gan (hepatocytes), đại thực bào và các tế bào biểu mô ruột. Một vài protein bổ thể liên kết với kháng thể miễn dịch hoặc với các thành phần của màng tế bào. Các loại bổ thể khác là các proenzyme mà khi đƣợc hoạt hóa sẽ cắt một hoặc nhiều các protein bổ thể khác. Các mảnh đƣợc cắt ra từ các protein bổ thể có thể hoạt hóa tế bào, làm tăng khả năng thấm vào mạch máu hoặc opsonin hóa tế bào vi khuẩn.
Hình 4.1: Vai trò của bổ thể trong hoạt hóa tế bào B Nguồn: 2011, Miễn dịch học phân tử, Đại học Huế
Ngoài kháng nguyên, sự hoạt hóa tế bào B còn đòi hỏi những tín hiệu do các protein bổ thể cung cấp. Hệ thống bổ thể bao gồm một loạt protein huyết thanh đƣợc hoạt hóa bằng cách liên kết với phức hợp kháng nguyên-kháng thể hoặc liên kết trực tiếp lên polysaccharid của bề mặt vi khuẩn mà không cần có kháng thể (theo con đƣờng không cổ điển và lectin). Nhƣ vậy vi khuẩn có thể hoạt hóa trực tiếp hệ thống bổ thể, trong quá trình đáp ứng miễn dịch tự nhiên (hay bẩm sinh), hoặc sau khi liên kết với kháng thể. Kháng nguyên protein có thể gắn với kháng thể tƣơng ứng tồn tại từ trƣớc đó, và phức hợp này hoạt hóa bổ thể bằng con đƣờng cổ điển. Sự hoạt hóa bổ thể gây ra phân cắt các protein của hệ thống bổ thể. Thành phần chủ yếu của hệ thống là một protein gọi là C3, việc phân cắt C3 tạo ra một phân tử gọi là C3b có khả năng liên kết đồng hó trị với vi khuẩn hoặc phức hợp kháng nguyên-kháng thể. C3b lại đƣợc phân cắt thêm để cho ra một mảnh gọi là C3d, mảnh này vẫn còn gắn trên vi khuẩn. Trên màng tế bào B có một thụ thể dành cho C3d đƣợc gọi là thụ thể bổ thể typ 2 (tức CR2 hay CD21). Phức hợp tạo nên bởi Cd3 và kháng nguyên hoặc C3d với phức hợp kháng nguyên-kháng thể sẽ gắn vào tế bào B, trong đó Ig màng thì gắn với kháng nguyên còn CR2 thì gắn với C3d (Hình 5). CR2 đƣợc bộc lộ trên tế bào B trƣởng thành dƣới dạng kết hợp với hai protein màng khác là CD19 và CD81 (còn đƣợc gọi là TAPA-1). Phức hợp CR2- CD19-CD81 thƣờng đƣợc gọi là phức hợp đồng thụ thể tế bào B vì CR2 gắn với kháng nguyên qua mảnh C3d đồng thời với Ig màng gắn trực tiếp vào kháng nguyên. Sự liên kết của CD3 vào thụ thể bổ thể của tế bào B đã mang CD19 lại gần các kinase kết hợp BCR, và đuôi bào tƣơng của CD19 nhanh chóng đƣợc phosphoryl hóa. CD19 phosphoryl hóa sẽ hoạt hóa nhiều con đƣờng tín hiệu, mà quan trọng nhất là con đƣờng phụ thuộc PI-3 kinase là con đƣờng có thể khuyếch
đại tín hiệu do phức hợp kháng nguyên-Ig bề mặt tạo ra. Ngoài ra, các kinase thuộc họ Src liên kết với CD21 có thể phosphoryl hóa ITAM và khuyếch đại tín hiệu BCR. Kết quả là đáp ứng tế bào B ngày một mạnh lên.
Tầm quan trọng của hệ thống bổ thể trong đáp ứng miễn dịch dịch thể đã đƣợc chứng minh qua nhiều thí nghiệm, với kết quả là tính miễn dịch tạo ra khi có C3d mạnh hơn khi không có C3d 1.000 lần.
4.1.2 Các con đƣờng hoạt hóa bổ thể
Sự hoạt hóa bổ thể có thể chia vào trong bốn con đƣờng: con đƣờng truyền thống, con đƣờng lectin, con đƣờng thay thế và con đƣờng đính lên màng (hay còn gọi là con đƣờng lytic). Cả con đƣờng truyền thống và con đƣờng thay thể đề dẫn đến sự hoạt hóa enzyme chuyển C5 và dẫn đến sự tạo thành C5b, một chất cần thiết cho sự hoạt hóa con đƣờng đính lên màng tế bào.
4.1.2.1 Con đường truyền thống
Hoạt hóa C1
C1 là một phức hợp protein gồm 3 loại protein khác nhau (C1q, C1r và C1s) mà có thể liên kết với vùng cố định của phân tử kháng thể lớp IgG và IgM đã tƣơng tác với kháng nguyên. C1 không liên kết với những kháng thể chƣa gắn với kháng nguyên và sự liên kết diễn ra đòi hỏi sự có mặt của ion Canci và Magie (trong một vài trƣờng hợp C1 có thể liên kết với các kháng thể đã dính lại với nhau hoặc với bề mặt của các tác nhân gây bệnh trong sự vắng mặt của kháng thể). Sự liên kết với C1 với kháng thể thông qua C1q và C1q phải liên kết với ít nhất 2 phân tử kháng thể trƣớc khi nó đƣợc gắn cố định. Sự liên kết của C1q dẫn đến sự hoạt hóa của C1r mà sẽ hoạt hóa C1s. Kết quả là sự hình thành của một enzyme với các thành phần phức hợp C1qrs hoạt hóa sẽ cắt protein C4 thành 2 mảnh C4a và C4b.
Hoạt hóa C4 và C2 (sự tạo thành enzyme chuyển hóa C3)
Mảnh C4b liên kết với màng và mảnh C4a đƣợc giải phóng vào trong vi môi trƣờng (microenviroment). C1qrs hoạt hóa cũng cắt C2 thành C2a và C2b. C2a liên kết với màng để liên kết với C4b, và C2b đƣợc giải phóng vào vi môi trƣờng. Kết quả là phức hợp C4bC2a hình thành nên enzyme C3 mà sẽ cắt C3 thành C3a và C3b.
Hoạt hóa C3
C3b liên kết với C4b và C2a trên màng tế bào, C3a đƣợc giải phóng vào vi môi trƣờng. Kết quả là hình thành enzyme chuyển hóa C5 từ phức hợp C4bC2aC3b. Sự tạo thành enzyme chuyển hóa C5 là kết thúc của con đƣờng truyền thống.
Con đƣờng lectin khá giống với con đƣờng truyền thống. Nó bắt đầu bằng sự liên kết giữa lectin (có khả năng liên kết với mannose) với polysaccharides có chứa gốc mannose (mannans) ở trên bề mặt của tế bào vi khuẩn. Liên kết này sẽ tạo điều kiện cho việc gắn với enzyme proteases (loại chứa 2 serine), MASP-1 và MASP-2. MASP-1 và MASP-2 là tƣơng tự nhƣ C1r và C1s, mà lectin là tƣơng tự nhƣ C1q. Sự hình thành phức hợp gồm ba tiểu đơn vị lectin-MASP-1-MASP-2 dẫn đến sự hoạt hóa các enzyme phân cắt C4 thành C4a và C4b. Mảnh C4b liên kết với màng và mảnh C4a đƣợc giải phóng vào vi môi trƣờng. Phức hợp cũng đồng thời hoạt hóa các enzyme phân cắt C2 thành C2a và C2b. C2a liên kết với màng trong phức hợp với C4b và C2b đƣợc giải phóng vào vi môi trƣờng. Kết quả của phức hợp C4bC2a là tạo thành enzyme chuyển hóa C3, enzyme này phân cắt C3 thành C3a và C3b. C3b liên kết với màng trong phức hợp liên kết với C4b và C2a, còn C3a đƣợc giải phóng vào vi môi trƣờng. Kết quả là phức hợp C4bC2aC3b tạo thành enzyme chuyển hóa C5. Sự tạo thành enzyme này là kết thúc của con đƣờng lectin.
4.1.2.3 Con đường thay thế
Con đƣờng thay thế bắt đầu với sự hình thành C3 và đòi hỏi các nhân tố B, D và ion Mg2+.
Sự khuếch đại C3b
Trong huyết thanh có một sự thủy phân tự phát ở mức độ thấp các C3 để tạo thành C3i. Nhân tố B liên kết với C3i và trở nên dễ liên kết với nhân tố D hơn để phân cắt nhân tố B thành Bb. Phức hợp C3iBb hoạt động nhƣ một enzyme chuyển hóa C3 và phân cắt C3 thành C3a và C3b. Một khi C3b đƣợc hình thành, nhân tố B sẽ liên kết với nó và trở nên dễ bị phân cắt bởi nhân tố D hơn. Phức hợp C3bBb là enzyme chuyển hóa C3 và sẽ tiếp tục tạo ra nhiều C3b hơn, kết quả là khuếch đại