5.2.2.1 Sự ngưng kết và ngưng kết hồng cầu
Khi kháng nguyên là các hạt không hòa tan, phản ứng của kháng thể với kháng nguyên có thể đƣợc phát hiện bởi sự ngƣng kết kháng nguyên. Thuật ngữ “agglutinin” đƣợc sử dụng để mô tả kháng thể mà ngƣng kết các hạt kháng nguyên. Khi kháng nguyên là hồng cầu thuật ngữ “hemagglutination” (ngƣng kết hồng cầu) đƣợc sử dụng. Về mặt lý thuyết, tất cả các kháng thể có thể ngƣng kết các kháng nguyên hạt nhƣng riêng IgM do có hóa trị cao nên là một chất ngƣng kết tốt và thỉnh thoảng có thể đƣa ra kết luận một kháng thể là thuộc lớp IgM nếu nó là một kháng thể ngƣng kết tốt.
Test định tính bằng ngưng kết kháng nguyên
Test ngƣng kết có thể đƣợc sử dụng để định tính đối với những test kiểm tra sự tồn tại của kháng nguyên hoặc của kháng thể. Kháng thể đƣợc trộn lẫn với các kháng nguyên hạt và kết quả là dƣơng tính khi sự ngƣng kết kháng nguyên hạt xảy ra.
Ví dụ: Các tế bào hồng cầu của bệnh nhân đƣợc trộn với kháng thể nhận biết kháng nguyên của một nhóm máu xác định trong việc xác định nhóm máu. Ví dụ
thứ 2, huyết thanh của bệnh nhân đƣợc trộn với các tế bào hồng cầu của một nhóm máu đã biết để kiểm tra sự tồn tại của kháng thể nhận biết nhóm máu đó trong huyết thanh bệnh nhân.
Định lượng bằng test ngưng kết
Các test ngƣng kết đƣợc sử dụng để đo hàm lƣợng của kháng thể đối với kháng nguyên hạt. Trong các test này, một vài mức độ pha loãng của mẫu cần kiểm tra kháng thể đƣợc chuẩn bị và sau đó một số lƣợng cố định tế bào hồng cầu hoặc tế bào vi khuẩn hoặc các kháng nguyên hạt khác đƣợc thêm vào. Sau đó mức độ pha loãng lớn nhất mà xảy ra sự ngƣng kết đƣợc xác định. Mức độ pha loãng lớn nhất mà vẫn quan sát đƣợc sự ngƣng kết bằng mắt đƣợc gọi là “titer”. Kết quả đƣợc báo cáo là số đảo của mức độ pha loãng lớn nhất mà vẫn quan sát đƣợc sự ngƣng kết.
Hình 5.3: Định lượng bằng test ngưng kết Nguồn: Đại học South Carolina, American
Chú ý rằng, trong một vài trƣờng hợp chúng ta có thể không quan sát thấy sự ngƣng kết tại nồng độ cao của kháng thể (hay mức độ pha loãng mẫu nhỏ), nhƣng khi mẫu đƣợc pha loãng nhiều hơn, sự ngƣng kết lại xảy ra (trong ví dụ là bệnh nhân 6). Sự thiếu ngƣng kết tại nồng độ cao của kháng thể đƣợc gọi là ảnh hƣởng “prozone”. Sự thiếu ngƣng kết trong vùng prozone này là do sự dƣ thừa kháng thể dẫn đến một lƣợng rất nhỏ phức hợp có thể dính kết lại với nhau để hình thành sự ngƣng kết có thể quan sát đƣợc.
Các ứng dụng của test ngưng kết
- Xác định nhóm máu hoặc kháng thể đối với nhóm máu đã biết - Đánh giá việc nhiễm vi khuẩn
Ví dụ: việc tăng chỉ số titer của một kháng thể đối với một vi khuẩn ám chỉ một sự nhiễm loại vi khuẩn đó. Thông thƣờng chỉ số titer tăng gấp 4 đánh dấu sự tăng lên một cách có ý nghĩa trong chỉ số titer.
Trong thực tế, tuy test ngƣng kết dễ thực hiện nhƣng nó chỉ là bƣớc đánh giá ban đầu.
5.2.2.2 Ngưng kết hồng cầu thụ động (Passive hemagglutination)
Test ngƣng kết chỉ hoạt động với các kháng nguyên hạt. Tuy nhiên, có thể phủ hồng cầu bằng các kháng nguyên hòa tan (ví dụ: kháng nguyên virus, polysaccharide hoặc một hapten) và sử dụng các tế bào hồng cầu đã đƣợc phủ này trong các test ngƣng kết kháng thể nhận biết kháng nguyên hòa tan. Đó đƣợc gọi là ngƣng kết hồng cầu thụ động. Test này đƣợc thực hiện giống nhƣ test ngƣng kết. Ứng dụng bao gồm phát hiện kháng thể nhận biết kháng nguyên hòa tan và sự phát hiện kháng thể nhận biết kháng nguyên virus.
Hình 5.4: Ngưng kết hồng cầu thụ động Nguồn: Đại học South Carolina, American
5.2.2.3 Các test Coomb
Test Coomb trực tiếp
Khi kháng thể liên kết với hồng cầu, không phải lúc nào cũng dẫn đến sự ngƣng kết. Điều này có thể là kết quả từ tỉ lệ kháng nguyên kháng thể hoặc trong một vài trƣờng hợp sự tích điện trên tế bào hồng cầu ngăn cản sự liên kết giữa các tế bào. Các kháng thể liên kết nhƣng không gây ra sự ngƣng kết hồng cầu thỉnh thoảng đƣợc ám chỉ nhƣ kháng thể không hoàn toàn. Sự không hoàn toàn này không ám chỉ tới cấu trúc của nó mà chỉ đơn giản là chức năng của nó. Để phát hiện sự tồn tại của các kháng thể không ngƣng kết trên tế bào hồng cầu, một cách đơn giản đó là thêm kháng thể thứ 2 trực tiếp kháng lại kháng thể phủ quanh hồng cầu. Kháng thể này bây giờ đã có thể liên kết gián tiếp với tế bào hồng cầu và dẫn đến sự ngƣng kết. Test này đƣợc biết nhƣ test Coomb trực tiếp.
Hình 5.5: Test Coomb trực tiếp Nguồn: Đại học South Carolina, American
Test Coomb gián tiếp
Nếu cần thiết để biết mẫu huyết thanh có kháng thể trực tiếp kháng lại tế bào hồng cầu hạt hay không và nếu muốn đảm bảo phát hiện các kháng thể không ngƣng kết trong mẫu, một test Coomb gián tiếp đƣợc thực hiện. Test này đƣợc thực hiện bằng cách ủ tế bào hồng cầu với mẫu huyết thanh, rửa sạch các kháng thể không liên kết và sau đó thêm kháng thể thứ 2 kháng lại kháng thể miễn dịch (anti- immunoglobulin) để liên kết các tế bào.
Hình 5.6: Test Coomb gián tiếp Nguồn: Đại học South Carolina, American
Ứng dụng
Ứng dụng của phƣơng pháp này bao gồm việc phát hiện các kháng thể kháng nhân tố rhesus (Rh). Kháng thể kháng nhân tố Rh nhìn chung không làm ngƣng kết hồng cầu. Vì vậy, tế bào hồng cầu từ những đứa trẻ Rh+
đƣợc sinh ra từ mẹ Rh-, ngƣời có kháng thể kháng Rh, có thể đƣợc phủ những kháng thể này. Để kiểm tra điều này, một test Coomb trực tiếp đƣợc thực hiện. Để kiểm tra ngƣời mẹ có chứa kháng thể kháng Rh trong huyết thanh hay không thì một test Coomb gián tiếp đƣợc thực hiện.
5.2.2.4 Ức chế ngưng kết hồng cầu (Hemagglutination Inhibition)
Các test ngƣng kết có thể đƣợc thay đổi để đƣợc sử dụng cho việc đo đạc kháng nguyên hòa tan. Test này đƣợc gọi là sự ức chế ngƣng kết hồng cầu. Nó đƣợc gọi là sự ức chế ngƣng kết hồng cầu vì nó đƣợc đo bằng khả năng kháng nguyên hòa tan ức chế sự ngƣng kết của các tế bào hồng cầu đã đƣợc phủ kháng nguyên bằng kháng thể. Trong những test này, một hàm lƣợng cố định kháng thể kháng kháng nguyên chƣa biết đƣợc trộn với một lƣợng cố định tế bào hồng cầu đã đƣợc phủ kháng nguyên. Hỗn hợp này đƣợc trộn với các mẫu khác nhau để đánh giá sự tồn tại của kháng nguyên. Nếu mẫu chứa kháng nguyên, kháng nguyên hòa tan sẽ cạnh tranh với kháng nguyên đƣợc phủ trên bề mặt tế bào hồng cầu để liên kết với kháng thể, vì vậy ức chế sự ngƣng kết của tế bào hồng cầu.
Bằng một dãy cách mẫu đã pha loãng, ta có thể định lƣợng hàm lƣợng kháng nguyên ở trong mẫu bằng titer của nó. Test này nhìn chung đƣợc sử dụng để định lƣợng kháng nguyên hòa tan tuy nhiên sai số của nó là tƣơng đối lớn.
Hình 5.7: Test ức chế ngưng kết hồng cầu Nguồn: Đại học South Carolina, American