Phƣơng pháp Elisa đƣợc phát triển từ phƣơng pháp miễn dịch phóng xạ (Radioimmunoassay-RIA). Trong đó, kháng nguyên hoặc kháng thể sẽ đƣợc đánh dấu bằng một chất phóng xạ. Kết quả của phản ứng dựa vào việc đo mức độ phóng xạ của chất phóng xạ đƣợc cho liên kết với phức hợp miễn dịch. Do sự nguy hiểm của chất phóng xạ mà sau này ngƣời ta đã thay thế chúng bằng các enzyme để đánh dấu kháng nguyên hoặc kháng thể.
5.2.4.1 Nguyên tắc
Phƣơng pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay- xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme) có rất nhiều dạng mà đặc điểm chung là đều dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể hoặc kháng nguyên đƣợc gắn với một enzyme. Khi cho thêm cơ chất thích hợp vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu. Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông qua cƣờng độ màu mà biết đƣợc nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện.
Phƣơng pháp này đƣợc thiết kế cho việc phát hiện và định lƣợng vật chất nhƣ peptides, protein, antibodies, hormone,… Đôi khi nó còn đƣợc gọi bởi một tên gọi khác là EIA (Enzyme ImmunoAssay)
Kĩ thuật này khá nhạy và đơn giản, cho phép ta xác định kháng nguyên hoặc kháng thể ở một nồng độ rất thấp (khoảng 0,1 ng/ml). So với kĩ thuật miễn dịch phóng xạ (RIA- Radio Immuno Assay) thì kĩ thuật này rẻ tiền và an toàn hơn mà vẫn đảm bảo độ chính xác nhƣ nhau. ELISA đƣợc dùng để xác định nhiều tác nhân gây bệnh nhƣ virus, vi khuẩn, nấm, kí sinh.
Kĩ thuật ELISA gồm ba thành phần tham gia phản ứng là: kháng nguyên, kháng thể và chất tạo màu; thực hiện qua hai bƣớc:
- Phản ứng miễn dịch học: Là sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể. Kháng nguyên hoặc kháng thể đƣợc gắn lên trên bề mặt của đĩa có 96 giếng, sau đó đƣợc cho phản ứng với kháng thể hoặc kháng nguyên đã đƣợc gắn với một enzyme, kháng nguyên hoặc kháng thể dƣ thừa sẽ đƣợc rửa trôi đi.
- Phản ứng hóa học: Khi cho cơ chất vào hỗn hợp phản ứng, thông qua hoạt tính xúc tác của enzyme làm giải phóng oxy nguyên tử [O] từ H2O2 để oxy hóa cơ chất chỉ thị màu, do đó làm thay đổi màu của hỗn hợp trong dung dịch thí nghiệm. Cƣờng độ màu đƣợc đo thông qua máy quang phổ có các bƣớc sóng khác nhau.
5.2.4.2 Phân loại Elisa a. Elisa trực tiếp
Đây là dạng đơn giản nhất của phƣơng pháp ELISA. Trong đó, kháng nguyên cần phát hiện sẽ đƣợc gắn trực tiếp lên bề mặt giá thể và sẽ đƣợc phát hiện bằng một kháng thể duy nhất (kháng thể này đã đƣợc gắn enzyme).
Hình 5.8: Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA trực tiếp Nguồn: Đại học South Carolina, American
- Ƣu điểm: Đơn giản nhất - Nhƣợc điểm: Cố định kháng nguyên vào các giếng Blocking các giếng, rửa Thêm kháng thể có gắn enzyme
Rửa Thêm cơ chất, đọc
tín hiệu bằng máy đo quang phổ
+ Độ đặc hiệu bị giới hạn vì thƣờng thì kháng nguyên có ít nhất là 2 epitope (trình diện kháng nguyên) mà phƣơng pháp này chỉ sử dụng 1 kháng thể gắn vào một epitope.
+ Phải đánh dấu cho từng kháng thể chuyên biệt với từng đối tƣợng.
b. Elisa gián tiếp
Phƣơng pháp này khác ELISA trực tiếp ở chỗ kháng thể bắt kháng nguyên không đƣợc gắn enzyme mà nó là mục tiêu gắn đặc hiệu của một kháng thể khác (kháng thể này mới là kháng thể đƣợc gắn với enzyme).
Hình 5.9: Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA gián tiếp Nguồn: Đại học South Carolina, American
- Ƣu điểm: Kháng thể gắn enzyme có thể sử dụng để đánh dấu cho nhiều loại kháng nguyên nên tiện lợi và kinh tế hơn, dễ dàng thƣơng mại hóa.
- Nhƣợc điểm: Độ đặc hiệu và độ nhạy không cao.
c. Sandwich Elisa
Đây là một dạng ELISA đƣợc sử dụng phổ biến nhất trong thực tiễn do nó cho phản ứng mạnh và nhạy. Đƣợc gọi là “sandwich” là do kết quả thí nghiệm đƣợc
Cố định kháng nguyên vào các giếng Blocking các giếng, rửa Thêm kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên Rửa Thêm cơ chất Thêm kháng thể có gắn enzyme đặc hiệu với kháng thể 1 Rửa Đọc tín hiệu bằng
đánh giá thông qua sự kết hợp của hai loại kháng thể là kháng thể bắt (capture antibodies) và kháng thể phát hiện (detection antibodies). Kỹ thuật này cũng đƣợc phân làm hai dạng là sandwich ELISA trực tiếp (DAS-ELISA - Double antibody sandwich) và sandwich ELISA gián tiếp (TAS-ELISA – Triple antibody sandwich).
DAS ELISA gồm sự dính thụ động của kháng thể bắt vào pha rắn (đáy giếng). Những kháng thể này sau đó kết hợp với các kháng nguyên đƣợc thêm vào. Những kháng nguyên đƣợc pha loãng trong blocking buffer nhằm ngăn sự dính không chuyên biệt của chúng vào pha rắn. Ở đây, những phần của blocking buffer không nên chứa bất kỳ kháng nguyên nào mà có thể kết hợp với kháng thể bắt. Sau khi ủ và rửa, chỉ còn phức hợp kháng nguyên - kháng thể dính vào pha rắn. Kháng thể phát hiện có gắn enzyme sau đó đƣợc thêm vào. Kháng thể thứ hai này có thể giống kháng thể một hoặc khác về nguồn động vật hay loài động vật sản xuất kháng thể. Sau khi ủ, rửa, thêm cơ chất vào và đọc trên máy đo quang phổ.
Nếu sử dụng kháng thể bắt và kháng thể phát hiện giống nhau, hệ thống sẽ bị giới hạn ở chỗ kháng nguyên phải có ít nhất hai epitope vì cả hai kháng thể bắt và phát hiện đều kết hợp trực tiếp với kháng nguyên.
Để khắc phục điều này có thể sử dụng kháng thể bắt trên pha rắn và kháng thể phát hiện chống lại những epitope khác nhau trên phức hợp kháng nguyên. Do đó, thuận lợi khi khảo sát sự khác biệt nhỏ giữa những kháng nguyên nếu sử dụng kháng thể phát hiện và kháng thể bắt khác nhau. Việc sử dụng cùng một kháng thể bắt và phát hiện có thể dẫn đến vấn đề khi có giới hạn về vị trí gắn kết sẵn có cho sự phát hiện. Kích thƣớc và mối quan hệ không gian của các epitope trên kháng nguyên đích là rất quan trọng và có thể ảnh hƣởng mạnh đến thử nghiệm.
Sandwich ELISA có thể đƣợc chia làm hai hệ thống:
Hình 5.10: Tiến trình thực hiện ELISA Sandwich trực tiếp Nguồn: Đại học South Carolina, American
- Ƣu điểm:
+ Độ nhạy và độ đặc hiệu cao
+ Có thể phát hiện sự khác biệt nhỏ giữa các kháng nguyên nếu sử dụng kháng thể bắt và kháng thể phát hiện khác nhau.
- Nhƣợc điểm: phƣơng pháp này bị giới hạn về chuẩn bị kháng thể, vì mỗi kháng thể đƣợc sử dụng phải đƣợc đánh dấu riêng (cho những kháng nguyên khác nhau).
Chú ý: nếu sử dụng kháng thể bắt và kháng thể phát hiện giống nhau có thể dẫn đến vấn đề nếu có sự giới hạn vị trí kết hợp sẵn có để phát hiện. Mối quan hệ về kích thƣớc và vị trí không gian của các epitope cũng có ảnh hƣởng đến thử nghiệm.
Sandwich ELISA gián tiếp
Cố định kháng thể vào các giếng
Kháng nguyên hòa tan trong blocking buffer được
thêm vào
Rửa
Thêm vào kháng thể có
gắn enzyme Cơ chất được thêm
vào
Đo độ hấp phụ bằng máy đo
Hình 5.11: Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA Sandwich gián tiếp Nguồn: Đại học South Carolina, American
Khắc phục đƣợc nhƣợc điểm của sanwich ELISA trực tiếp trong việc chuẩn bị kháng thể.
d. Elisa ức chế/cạnh tranh (Competition Elisa, C-Elisa)
Phản ứng cạnh tranh mang nghĩa là hai chất tham gia phản ứng cùng ái lực bắt cặp với chất thứ ba. Phản ứng cạnh tranh đúng đắn thì hai chất cạnh tranh phải đƣợc đƣa vào đồng thời.
Cả hai phản ứng ức chế và cạnh tranh đều có sự tham gia của hai kháng thể phản ứng với kháng nguyên. Nếu một kháng thể đƣợc ủ trƣớc phản ứng đó đƣợc gọi là ức chế (blocking/ inhibition assays). Phản ứng cạnh tranh mang nghĩa cả hai kháng thể đƣợc thêm vào đồng thời với nhau
C-Elisa trực tiếp (Direct C-Elisa): Kiểm tra kháng nguyên
Quá trình tiến hành C- Elisa trực tiếp kiểm tra trực tiếp đƣợc mô tả nhƣ trong hình sau.
Trong hệ thống trực tiếp, lƣợng kháng nguyên trên bề mặt đĩa và lƣợng kháng thể gắn enzyme đã đƣợc chuẩn độ để tối ƣu. Kháng nguyên và kháng thể gắn enzyme đƣợc thêm vào đĩa cùng một lúc để tạo ƣu thế cạnh tranh.
Nếu kháng nguyên tƣơng tự hoặc cùng nhƣ kháng nguyên đã đƣợc gắn trên đĩa thì kháng thể gắn enzyme sẽ gắn lên kháng nguyên này. Khi nồng độ của kháng nguyên cạnh tranh cao sẽ ngăn cản bất kỳ sự kết hợp của kháng thể gắn enzyme với kháng nguyên trên bề mặt đĩa (cạnh tranh 100%). Nếu nồng độ kháng nguyên cạnh
Cố định kháng thể vào các
giếng
Kháng nguyên hòa tan trong blocking buffer được thêm vào,
rửa
Thêm cơ chất, đo độ hấp phụ bằng
máy đo quang phổ Thêm vào kháng thể 2, rửa Thêm vào kháng thể kháng kháng thể 2, rửa
tranh giảm (ví dụ : pha loãng) sự cạnh tranh sẽ giảm. Nhƣ vậy nồng độ kháng nguyên cạnh tranh càng cao thì độ hấp thu màu càng giảm.
Kháng nguyên cạnh tranh có thể đƣợc thêm trực tiếp vào đĩa nếu nó đƣợc pha loãng trong blocking buffer trƣớc khi thêm kháng thể gắn enzyme.
Mức độ cạnh tranh theo thời gian phụ thuộc vào mối tƣơng quan của nồng độ phân tử cần kiểm tra và kháng nguyên trên bề mặt đĩa (và mức độ tƣơng đồng của kháng nguyên).
Sau khi ủ và rửa, lƣợng kháng thể đƣợc đánh dấu đƣợc định lƣợng sau khi thêm cơ chất. khi không có kháng nguyên trong mẫu kiểm tra hay không có sự tƣơng đồng của kháng nguyên thì không có sự gắn kết với kháng nguyên đƣợc đánh dấu và không có sự cạnh tranh với kháng nguyên này. Kết quả là mẫu có chứa kháng nguyên thì sự cạnh tranh làm giảm cƣờng độ màu còn đối chứng âm thì không.
Hình 5.12: Direct C-ELISA kiểm tra kháng nguyên Nguồn: Đại học South Carolina, American
C-Elisa trực tiếp: Kiểm tra kháng thể
C-ELISA trực tiếp kiểm tra kháng thể tƣơng tự với C-ELISA trực tiếp kiểm tra kháng nguyên. Sự cạnh tranh ở đây là giữa kháng thể trong mẫu và kháng thể đƣợc đánh dấu với các vị trí trên kháng nguyên trên đĩa. Mẫu và kháng thể đánh dấu đƣợc trộn với nhau trƣớc khi thêm vào đĩa.
Hình 5.13: Direct C-ELISA kiểm tra kháng thể Nguồn: Đại học South Carolina, American
5.2.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng
Các yếu tố ảnh hưởng đến độ nhạy của phản ứng ELISA
Số lƣợng kháng thể thứ nhất hoặc kháng nguyên đƣợc gắn vào đáy giếng
Ái lực của kháng thể thứ nhất đối với kháng nguyên
Ái lực của kháng thể thứ hai đối với kháng nguyên
Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả ELISA
Nếu các đối chứng âm cho kết quả dƣơng tính thì có thể do sự nhiễm từ chất tạo màu hoặc từ kháng thể đƣợc đánh dấu hoặc chính các đối chứng bị nhiễm.
Nếu màu không xuất hiện đối với đối chứng dƣơng hoặc đối với mẫu thì phải kiểm tra lại tất cả hoá chất bao gồm: hạn sử dụng, nồng độ, điều kiện bảo quản.
Nếu màu xuất hiện quá thấp đối với đối chứng dƣơng và cả mẫu kiểm tra thì phải kiểm tra lại kháng thể đƣợc gắn enzyme và nồng độ của chất tạo màu.
Nếu có tạo màu đối với mẫu nhƣng không tạo màu với đối chứng dƣơng thì có thể kiểm tra lại nguồn gốc đối chứng, hạn sử dụng và điều kiện bảo quản.
Khi chạy lại một thử nghiệm trong điều kiện đang gặp sự cố thì chỉ nên thay đổi một yếu tố thí nghiệm.
5.2.4.4 Các enzyme và cơ chất thường được sử dụng trong phản ứng Elisa
Trong phản ứng Elisa, các enzyme thƣờng đƣợc sử dụng nhất hiện nay là: horseradish peroxidase (HRP), calf intestine alkaline phosphatase, E. coli ß-D- galactosidase. Các enzyme này có thể ổn định tại các nhiệt độ thông dụng nhƣ 4o
C, 25oC, 37oC, thời gian bảo quản dài hơn 6 tháng (tại 4oC), không đắt, sẵn có trên thị trƣờng, dễ dàng đo đạc kết quả, độ nhạy tƣơng đối, có thể tái sử dụng, không ảnh hƣởng đến các thành phần khác trong hỗn hợp phản ứng, và có thể cho liên kết đƣợc với cả kháng nguyên và kháng thể. Nhờ vào đặc điểm nổi trội của chúng mà các enzyme này còn đƣợc sử dụng phổ biến trong các kỹ thuật sinh học phân tử khác.
a. Peroxidase
Peroxidase là enzyme xúc tác các phản ứng oxy hóa một vài cơ chất hữu cơ trong sự có mặt của hydrogen peroxide (H2O2). Phân tử peroxidase có kích thƣớc nhỏ (khối lƣợng phân tử khoảng 40000) và thƣờng đƣợc cho gắn lên kháng thể với tỉ lệ 4:1. Nhờ vào kích thƣớc phân tử nhỏ mà nó hiếm khi gây ra những cản trở không gian cho phản ứng liên kết kháng nguyên-kháng thể. Peroxidase tƣơng đối rẻ so sánh với alkaline phosphatase, các cơ chất của chúng cũng dễ dàng tìm thấy trên thị trƣờng. Tất cả các phản ứng của enzyme peroxidase đòi hỏi phải có H2O2, và khuyến nghị nên sử dụng H2O2 đã đƣợc cân bằng có bán trên thị trƣờng. Sự không thuận lợi chính của peroxidase là sự không tƣơng thích của chúng với chất bảo quản sodium azide (một chất bảo quản thƣờng đƣợc sử dụng để ức chế vi sinh vật tạp nhiễm). Sodium azide tại nồng độ thấp đã có thể làm bất hoạt peroxidase. Những thành phần và yếu tố khác có thể gây ảnh hƣởng đến hoạt động của peroxidase là kim loại đƣợc tìm thấy trong nƣớc và peroxidase ngoại loại có mặt trong các mẫu sinh học. Những điểm bất lợi này có thể đƣợc khắc phục bằng các sử dụng buffer vô trùng không sử dụng chất bảo quản, sử dụng nƣớc khử ion 2 lần để hòa tan enzyme,
và khử hoạt động của peroxidase có trong mẫu với H2O2 và rửa trôi đi trƣớc khi thêm enzyme vào.
Các cơ chất phổ biến phản ứng với enzyme peroxidase cho sản phẩm không hòa tan là TMB (3,3',5,5' tetramethylbenzidine), DAB (3,3',4,4' diaminobenzidine), và 4CN (4-chloro-1-naphthol). Các cơ chất cho sản phẩm hòa tan là TMB, ABTS (2,2'-azino-di [3-ethylbenzthiazoline] sulfonate), và OPD (o-phenylenediamine). TMB là cơ chất có độ nhạy cao, tốc độ phản ứng nhanh. Các cơ chất cho sản phẩm hòa tan thƣờng đƣợc sử dụng trong phản ứng Elisa. TMB tạo ra sản phẩm có màu xanh da trời đƣợc đo tại bƣớc sóng 650nm. Phản ứng oxy hóa TMB có thể đƣợc dừng bởi 1M phosphoric acid, lúc này sản phẩm tạo thành trong môi trƣờng acid sẽ có màu vàng và có thể đo tại bƣớc song 450nm. ABTS tuy có độ nhạy thấp hơn TMB và OPD nhƣng nó có thể đƣợc coi là một cơ chất có nhiều ứng dụng vì nó có thể là cơ chất cho cả peroxidase và alkaline phosphatase. Sản phẩm tạo thành của ABTS là phức hợp có màu xanh giữa xanh và xanh lá cây có thể đo đƣợc tại bƣớc sóng 405 đến 410nm. Phản ứng với cơ chất ABTS có thể đƣợc dừng bởi 1%SDS (sodium dodecyl sulfate) mà không làm thay đổi màu hoặc độ hấp phụ của sản phẩm phản ứng. OPD là cơ chất phổ biến nhất cho enzyme peroxidase tuy độ nhạy của nó kém hơn TMB đôi chút. Sản phẩm phản ứng của nó có màu vàng và đƣợc đo tại bƣớc sóng 490nm.
b. Alkaline phosphatase
Alkaline phosphatase là enzyme thủy phân xúc tác phản ứng cắt nhóm phosphate ra khỏi nhiều hợp chất sinh học ( protein, nucleotide ...) và nó hoạt động hiệu quả nhất trong môi trƣờng kiềm nên còn có tên gọi khác là basic phosphatase. Alkaline phosphatase có kích thƣớc lớn hơn gần gấp đôi peroxidase (khối lƣợng phân tử khoảng 86 000). Điều này có nghĩa enzyme này có thể gây ra những cản trở không gian cho phản ứng kháng nguyên-kháng thể dẫn tới những hiệu quả thấp hơn mong đợi. Alkaline phosphatase đắt hơn peroxidase một ít nhƣng nó ổn định hơn. Cơ chất phản ứng với alkaline phosphatase cho độ nhạy cao hơn với tín hiệu mạnh hơn. Điểm không thuận lợi của enzyme này đó là nó bị bất hoạt bởi các chất tạo vòng với kim loại (EDTA), trong môi trƣờng pH acid (pH < 4,5), hoặc các muối phosphate vô cơ. Vì vậy, không sử dụng phosphate buffered saline (PBS-một buffer thông dụng đƣợc trong các thí nghiệm sinh học) để rửa hoặc hòa tan các chất trong phản ứng với alkaline phosphatase. Tuy nhiên, EDTA và pH acid đƣợc sử dụng nhƣ một chất dừng phản ứng alkaline phosphatase rẻ tiền và thuận tiện.