1.2. Virus gây bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan tạo biểu mô
1.2.6. Phương pháp phát hiện IHHNV
1.2.6.1. Mô mục tiêu dùng để phát hiện và chẩn đoán bệnh do IHHNV
Các mô mục tiêu chủ yếu dùng để phát hiện IHHNV bao gồm: mang, hạch tạo máu và tế bào máu, bó dây thần kinh bụng và hạch thần kinh, các tế bào biểu mô của tuyến ăn ten và các tế bào nhu mô thuộc cơ quan bạch huyết [30 và 32].
Vì thế đối với tôm nguyên con như ấu trùng hoặc hậu ấu trùng hoặc mẫu mô có các mô mục tiêu như đã liệt kê ở Bảng 1.2 thì phù hợp để phát hiện IHHNV bằng phương pháp sinh học phân tử. Đối với các trường hợp cá thể bố mẹ có giá trị cao, cần thiết có thể thu thập các mẫu huyết tương hoặc chân bơi để phân tích IHHNV
Chương 1. Tổng quan tài liệu Phạm Văn Hùng
bằng kỹ thuật PCR hoặc lai dot-blot với các mẫu dò đặc hiệu [44].
Bảng 1.2. Mô mục tiêu của tôm được sử dụng để chẩn đoán bệnh do virus IHHNV [32]
Mô mục tiêu Vị trí tốt nhất để chẩn đoán bệnh do IHHNV Mang và thể gốc
mang
Biểu bì biểu mô và các cơ hỗ trợ
Dây thần kinh Bó thần kinh nằm ở dây thần kinh bụng hoặc trong các sợi thần kinh ngoại biên của phụ bộ
Hạch thần kinh Các tế bào hỗ trợ trong hạch mắt và dây thần kinh bụng Các hạch tạo máu ở
thượng vị
Ở các hạch tạo máu hiện diện dọc theo động mạch chủ trước ở lưng
Hạch tạo máu ở chân hàm
Ở các hạch tạo máu trong chân hàm thứ 2 và thứ 3 Tuyến râu Ở các tế bào biểu mô thuộc các ống nhỏ của tuyến râu Biểu bì Ở biểu mô, biểu bì
Ruột trước Biểu mô biểu bì và các mô liên kết cận biểu bì Tim Ở các mô liên kết xung quanh tim
Cơ quan bạch huyết Ở nhu mô hoặc mô liên kết 1.2.6.2. Phương pháp phát hiện
Hiện nay có nhiều phương pháp sẵn có dùng để phát hiện và chẩn đoán IHHNV. Việc chỉ định sử dụng phương pháp trong Bảng 1.3 được biểu thị như sau:
a là phương pháp tiện lợi, đặc hiệu và nhạy để chẩn đoán; b là phương pháp có độ nhạy và đặc hiệu tốt; c là phương pháp ứng dụng trong một số trường hợp nhưng do chi phí, độ chính xác hoặc các yếu tố khác đã làm hạn chế đáng kể các ứng dụng này và d là phương pháp không nên sử dụng vào mục đích khảo sát và chẩn đoán [44]. Những phương pháp này ít nhiều dựa trên các yếu tố có liên quan như độ tin cậy, độ nhạy, độ đặc hiệu và tính hữu dụng.
Mặc dù không phải tất cả các phương pháp thuộc nhóm a hoặc b đều được chuẩn hóa và phê duyệt giá trị sử dụng, nhưng trên thực tế các phép thử thuộc nhóm này đã là phương pháp thường quy, cho kết quả rõ ràng, được chấp nhận và sử dụng một cách rộng rãi [44]. Trong đó PCR là phương pháp tiện lợi dùng để phát hiện
Chương 1. Tổng quan tài liệu Phạm Văn Hùng
IHHNV. Tuy nhiên khi cần chứng minh các phần tổn thương bệnh đặc trưng ở biểu mô biểu bì do IHHNV gây ra thì cần sử dụng phương pháp mô học là phù hợp nhất.
Bảng 1.3. Một số phương pháp được sử dụng để phát hiện và chẩn đoán bệnh do IHHNV [44]
Khảo sát Khẳng định bệnh Phương pháp
Ấu trùng
Hậu ấu trùng
Tôm non
Trưởng thành
Sàng lọc Khẳng định
Quan sát dấu hiệu d d d d d d
Thử nghiệm sinh học d d d d d d Quan sát trực tiếp dưới
kính hiển vi quang học d d d d d d
Mô học d d c c a a
Kính hiển vi điện tử
truyền suốt (TEM) d d d d c c
Phương pháp dựa trên kháng thể
d d d c d d Mẫu dò DNA - lai tại chổ d d b b a a
PCR a a a a a a
Giải trình tự d d d d d a
Chú thích: a: phương pháp tiện lợi, đặc hiệu và nhạy; b: phương pháp nhạy và đặc hiệu;
c: phương pháp ứng dụng trong một số trường hợp; d: là phương pháp không nên sử dụng vào mục đích khảo sát và chẩn đoán.
− Phương pháp mô học: đối với tôm bị nhiễm IHHNV cấp tính có thể sử dụng phương pháp mô học để chẩn đoán. Chứng minh mô học dễ thấy nhất trong nội bào đó là xuất hiện thể vùi dạng Cowdry type A là tín hiệu để chẩn đoán mô đích bị nhiễm IHHNV [19 và 32]. Khi tiến hành nhuộm haematoxylin và eosin (H&E) các mô đã được cố định trong dung dịch có acid acetic như Davidson’s và Bouin’s, thể vùi bị bệnh hoại tử do IHHNV có đặc điểm như ưa eosin và thường xuất hiện quầng xung quanh, các thể vùi nằm trong vòng nhiễm sắc, nhân của các tế bào trong các mô có nguồn gốc ngoại bì như biểu bì, biểu mô của ruột trước và sau, dây thần kinh và hạch thần kinh và mô có nguồn gốc từ trung bì như: cơ quan tạo máu, tuyến ăn ten, tuyến sinh dục, cơ quan bạch huyết
Chương 1. Tổng quan tài liệu Phạm Văn Hùng
và mô liên kết có xu hướng phình to ra (Hình 1.5) [30, 32 và 44].
Hình 1.5. Ảnh mô học của tôm P. stylirostris bị bệnh hoại tử cấp.
Ảnh chụp dưới kính hiển vi quang học độ phóng đại 1.800 lần [32]
− Phương pháp sinh học phân tử: các phương pháp phát hiện trực tiếp sử dụng mẫu dò DNA đặc hiệu cho IHHNV như dot-blot và lai tại chổ (ISH). Kỹ thuật PCR đã được phát triển và ứng dụng để phân tích IHHNV. Một số bộ sinh phẩm dựa trên kỹ thuật PCR đã phát triển thành dạng sản phẩm thương mại. Các phương pháp này cho phép chẩn đoán IHHNV với độ nhạy cao hơn so với các kỹ thuật truyền thống [44]. Hơn nữa các phương pháp này có thêm điểm thuận lợi là có thể chẩn đoán IHHNV nhưng không làm chết vật nuôi có giá trị.
− Phương pháp PCR: hiện nay có một số phương pháp như PCR một bước [43], realtime PCR [24 và 52] và một số bộ sinh phẩm PCR dùng để phát hiện IHHNV dựa trên nhiều cặp mồi đã được thiết kế và công bố (Bảng 1.4) [ 32 và 44]. Trong đó hai cặp mồi 389F/R và 392F/R có khả năng bắt cặp để khuếch đại ORF bên trái của bộ gen IHHNV, là những cặp mồi phù hợp để phát hiện tất cả các biến thể di truyền của IHHNV đã được phát hiện, bao gồm đoạn trình tự DQ228358. Cặp mồi 77012F/77353R khuếch đại vùng trình tự giữa ORF2 và ORF3 [44]. Mồi 309F/R chỉ khuếch đại IHHNV, không khuếch trình tự
Chương 1. Tổng quan tài liệu Phạm Văn Hùng
DQ228358 [55]. Vị trí tương đối của các cặp mồi trên bộ gen IHHNV (AF218266.2) được minh họa ở Hình 1.6. Mồi MG831F/R là cặp mồi được thiết kế dùng để chỉ khuếch đại trình tự DQ228358 [56].
Bảng 1.4. Trình tự mồi dùng phân tích IHHNV bằng kỹ thuật PCR [44]
Tên mồi Sản phẩm
Trình tự G+C %/
nhiệt độ (toC)
389F 5’-CGGAACACAACCCGACTTTA-3’ 50/72
389R
389 bp
5’-GGCCAAGACCAAAATACGAA-3’ 45/71 77012F 5’-ATCGGTGCACTACTCGGA-3’ 50/68 77353R
356 bp
5’-TCGTACTGGCTGTTCATC-3’ 55/63
392F 5’-GGGCGAACCAGAATCACTTA-3’ 50/68
392R 392 bp
5’-ATCCGGAGGAATCTGATGTG-3’ 50/71
309F 5’-TCCAACACTTAGTCAAAACCAA-3’ 36/68
309R
309 bp
5’-TGTCTGCTACGATGATTATCCA-3’ 40/69 MG831F 5’-TTGGGGATGCAGCAATATCT-3’ 45/58 MG831R
831 bp
5’-GTCCATCCACTGATCGGACT-3’ 55/62
Hình 1.6. Sơ đồ vị trí tương đối các cặp mồi 392F/R, 389F/R, 309F/R và 77012F/77353R trên bộ gen IHHNV (AF218266.2).