CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.2. Tạo dòng và giải trình tự từng phần bộ gen IHHNV
2.2.5. Phương pháp tiến hành
2.2.5.1. Chuẩn bị khuôn DNA IHHNV
− Khuếch đại các đoạn DNA: bộ gen của IHHNV được khuếch đại bằng bảy cặp mồi (Bảng 2.2). Mỗi phản ứng PCR bao gồm 40 àl. Trong đú cú chứa dung dịch đệm, enzyme tag DNA polymerase, dNTP, mồi xuôi IHHNV F, mồi ngược IHHNV R, nước cất hai lần và 5 àl dịch ly trớch DNA IHHNV từ tôm. Nhiệt độ bắt cặp cho tất cả phản ứng là 55 oC. Điện di trên gel agarose các sản phẩm PCR để kiểm tra các đoạn DNA đã được khuếch đại.
− Tinh sạch DNA: bộ kit Wizard SV (Promega) [48] được sử dụng để tinh sạch sản phẩm PCR. Hệ thống này được thiết kế nhằm ly trích và tinh sạch các đoạn DNA có kích thước từ 100 bp đến 10 kb có trong sản phẩm PCR dựa trên khả năng DNA liên kết với màng silica có muối Chaotropic. Cho sản phẩm PCR vào dung dịch gắn cột, nạp mẫu vào cột. Khi đó DNA sẽ liên kết
Chương 2. Vật liệu – Phương pháp Phạm Văn Hùng
và bám trên bề mặt silica. Rửa màng và ly giải DNA bằng nước không có nuclease.
− Kiểm tra chất lượng DNA: sử dụng phương pháp điện di chip của hãng Agilent để kiểm tra độ tinh sạch và kích thước của các đoạn DNA và xác định nồng độ của chúng. Mỗi Agilent DNA chip có một hệ thống các đường rãnh cực nhỏ nối liền với nhau được sử dụng cho việc phân tách các đoạn acid nucleic dựa trên kích thước của chúng khi di chuyển trong quá trình điện di. Vị trí các đoạn DNA sẽ được hiển thị nhờ hóa chất nhuộm DNA.
Dựa vào thang chuẩn DNA, xác định được kích thước và nồng độ các đoạn DNA.
2.2.5.2. Tạo dòng và giải trình tự từng phần bộ gen IHHNV
− Giải trình tự DNA IHHNV: các đoạn DNA của IHHNV đã tinh sạch được đem giải trình tự trên máy 3130 xl Genetic Analyzer với bộ sinh phẩm giải trình tự có trình tự cuối gắn chất phát huỳnh quang BigDye®Terminator [13].
Phương pháp giải trình tự được tóm tắt gồm các bước thực hiện như sau:
+ Trước tiên sử dụng PCR với các mồi thiết kế dọc theo chiều dài của bộ gen IHHNV, sử dụng trình tự bộ gen IHHNV (EF633688.1) của Phúc Kiến để thiết kế mồi. Các mồi này sẽ khuếch đại các trình tự DNA dài 600 – 650 bp dọc theo chiều dài bộ gen IHHNV với một trình tự trùng lặp ở hai đầu của các trình tự kế nhau.
+ Giải trình tự sản phẩm PCR với 2 giai đoạn gồm thực hiện phản ứng chu kỳ nhiệt giải trình tự với BigDye Terminator 3.1 (ABI), loại bỏ các màu thừa bằng kết tủa sản phẩm giải trình tự với Ethanol và điện di sản phẩm giải trình tự trên thiết bị ABI 3130 xl (16 mao quản) sử dụng mao quản dài 80 cm, gel diện di là POP7.
+ Kết quả giải trình tự được phân tích trên phần mềm Sequencing Analysis 5.1.
Chương 2. Vật liệu – Phương pháp Phạm Văn Hùng
− Phương pháp đọc kết quả để lấy trình tự:
+ Sử dụng phần mềm Sequencing Analysis 5.1, chọn qui trình phân tích tiêu chuẩn dành cho BigDye 3.1, mao quản 80 cm và gel POP7 với các thông số yêu cầu là loại bỏ các tín hiệu nhiễu dưới 25 % cường độ, các giá trị được xem là có chất lượng để không loại bỏ tín hiệu là khi có 4 base không đạt trong khoản 20 base đọc được.
+ Chọn định dạng *AB1 để đưa trình tự vào phân tích với các thông số đã chọn và cài đặt. Phần mềm Sequencing Analysis 5.1 sẽ hiển thị trình tự phân tích dưới dạng biểu đồ các đỉnh tín hiệu (Electropherogram) với mỗi base sẽ có một màu, hay dạng trình tự kèm chất lượng tín hiệu. Cột xanh là chất lượng tín hiệu tốt, cột vàng hay đỏ là chất lượng tín hiệu xấu (do khoảng cách các đỉnh quá gần nhau hay bị một đỉnh khác bao phủ).
Một trình tự tốt khi trình tự kèm chất lượng trình tự là các cột màu xanh xuất hiện đều.
+ Trình tự của từng sản phẩm PCR lấy được trong nghiên cứu này là trình tự đã so cặp giữa chiều xuôi với chiều ngược sau khi đã đảo chiều và đảo mã của chiều ngược. Phần mềm để thực hiện đảo chiều và đảo mã cùng với so cặp hai trình tự là phần mềm BioEdit Sequence Aligment Editor.
Trình tự cuối cùng của từng sản phẩm PCR được lấy dựa trên các nguyên tắc sau: (1) chọn các trình tự so cặp giống nhau; (2) các base nào cho tín hiệu xấu (cột đỏ hay vàng) thì sẽ xem base đó trên trình tự so cặp, nếu giống nhau thì chọn, nếu khác nhau thì so với trình tự tham chiếu và chọn base giống trình tự tham chiếu, nếu không giống trình tự tham chiếu thì chọn base ở mạch có tín hiệu chất lượng hơn, nếu không có ở trình tự so cặp vì giải trình tự không tới thì vẫn lấy base có tín hiệu xấu này rồi sẽ điều chỉnh ở trình tự kế tiếp tại phần lặp lại.
+ Trình tự cuối cùng của bộ gen IHHNV được chọn là kết quả lắp ghép 7
Chương 2. Vật liệu – Phương pháp Phạm Văn Hùng
đoạn trình tự PCR đã giải được nhưng sẽ có điều chỉnh dựa trên nguyên tắc so cặp các đoạn trùng lắp và trên những đoạn trùng lắp này thì sẽ chọn base cho chất lượng tốt thay cho base cho chất lượng xấu.
− Kiểm tra sản phẩm sau giải trình tự: trình tự nt thu được sau giải trình tự từng phần được BLAST trên Ngân hàng gen nhằm đánh giá mức độ thành công của kết quả giải trình tự.
− Tạo dòng từng phần IHHNV: để lưu giữ nguồn DNA IHHNV, từng phần bộ gen IHHNV sau khi đã khuếch đại và tinh sạch được tạo dòng trong tế bào E.coli JM 109. Sử dụng hệ thống vector pGEM®-T Easy của hãng Promega [47].
− Kiểm tra kiết quả tạo dòng: để xác định kết quả tạo dòng, mồi IHHNV được sử dụng để chọn các dòng cần giữ lại.
2.2.5.3. Phân tích bộ gen IHHNV
− Xác định các khung đọc mở: ORF của bộ gen được xác định bằng phần mềm ORF Finder, DNA club và BioEdit là những phần mềm chuyên dụng để phân tích bộ gen. Khi sử dụng công cụ tìm kiếm ORF Finder và sử dụng các công cụ khác trên NCBI thì toàn bộ trình tự nt của bộ gen IHHNV được chuyển sang định dạng FASTA. Sử dụng phép so sánh nhiều trình tự nt của các ORF chính và trình tự a.a của protein được mã hóa từ các ORF chính để tìm kiếm cấu trúc tương đồng. Từ đó có thể dự đoán chức năng của các ORF chính thuộc bộ gen IHHNV.
− Xác định promoter giả định đóng vai trò điều hòa phiên mã: promoter là vùng trình tự đóng vai trò điều hòa phiên mã thường nằm phía trước của vùng trình tự có chức năng mã hóa. Trong luận án này, vùng trình tự giả định của promoter được xác định theo các bước sau: sử dụng phần mềm Neural Network Promoter Prediction program để dự đoán vùng trình tự có promoter
Chương 2. Vật liệu – Phương pháp Phạm Văn Hùng
giả định. Tiếp đến xác định vùng lỏi promoter theo hướng dẫn của Alan và James [12 và 26]. Vùng lỏi promoter thông thường có bán kính khoảng 35 nt tính theo chiều ngược hoặc chiều xuôi kể từ điểm bắt đầu phiên mã +1. Một số yếu tố lỏi của promoter cần xác định như: hộp TATA, yếu tố khởi đầu (Inr) và yếu tố lỏi chiều xuôi của promoter – DPE (Hình 2.4) [12 và 26].
Hình 2.4. Vị trí của các yếu tố lỏi promoter.
DPE có vị trí từ +28 đến +32 so với nt A+1 của Inr [12].
− Phân tích các vùng chức năng khác của bộ gen: trình tự DNA mã hóa cho protein khởi đầu sao chép I và II cùng với các vùng trình tự mã hóa cho NTP liên kết và enzyme helicase A, B và C là các vùng trình tự thường được phát hiện trên parvovirus. Sử dụng công cụ máy tính, phép so sánh giữa hai trình tự và phép so sánh nhiều trình tự để tìm kiếm các vùng trình tự DNA mã hóa cho protein khởi đầu sao chép I và II cùng với các vùng trình tự mã hóa cho NTP liên kết và enzyme helicase A, B và C trên bộ gen IHHNV [23 và 56].