CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.5. Thực nghiệm cảm nhiễm
3.5.2. Kết quả thực nghiệm cảm nhiễm
Thực nghiệm cảm nhiễm nhằm xác định các triệu chứng bệnh lý bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan tạo biểu mô do IHHNV gây ra trên tôm sú. Đồng thời xác định thời gian xâm nhiễm, thời gian ủ bệnh và thời điểm biểu hiện bệnh khi tôm bị phơi nhiễm với IHHNV. Thực nghiệm cảm nhiễm cũng nhằm mục tiêu kiểm chứng lại phương pháp PCR đã được xây dựng. Quá trình thực nghiệm được tiến hành trong 6 bể nuôi 50 lít có kiểm soát, 120 cá thể tôm/ bể. Trong đó 3 bể
Chương 3. Kết quả - Bàn luận Phạm Văn Hùng
- 104 -
nuôi đối chứng và 3 bể nuôi cảm nhiễm. Nhiệt độ nước nuôi từ 25 – 28 oC, độ mặn từ 20 – 25 0/00, pH của nước là 8 – 8,12. Phương pháp PCR với mồi 196F/R, phương pháp xét nghiệm mô học và quan sát sự thay đổi về hình thái của tôm nuôi được sử dụng để phân tích mẫu sau thực nghiệm cảm nhiễm. Kết quả thu nhận được trình bày tại Bảng 3.9 và Hình 3. 28.
Hình 3.26. Kết quả điện di sản phẩm PCR của thí nghiệm thực nghiệm cảm nhiễm IHHNV trên tôm sú.
M: thang DNA 100 – 1000 bp, (-):mẫu kiểm chứng âm IHHNV, (+): mẫu kiểm chứng dương IHHNV; thí nghiệm đối chứng (I): 1, 2 và 3; Thí nghiệm II: 4 – 12, mồi 196F/R.
Ở nhóm thí nghiệm I – thí nghiệm nuôi đối chứng, không phát hiện IHHNV ở tôm nuôi trong suốt 50 ngày nuôi thực nghiệm.
Ở nhóm thí nghiệm II – thí nghiệm cảm nhiễm, 3/3 bể nuôi cảm nhiễm được phát hiện nhiễm IHHNV sau 7 ngày tôm bị phơi nhiễm với IHHNV (Bảng 3.9 và Hình 3.26). Bệnh lý bệnh hoại cơ quan tạo máu và cơ quan tạo biểu mô biểu hiện ở mô được phát hiện sau 21 ngày phơi nhiễm và triệu chứng bệnh lý điển hình của
Chương 3. Kết quả - Bàn luận Phạm Văn Hùng
- 105 -
Nghiên cứu virus IHHNV (Infectious Hypodermal and Haematopoietic Necrosis Virus) trên tôm sú
tôm bị nhiễm IHHNV quan sát được bằng mắt thường sau 40 ngày tôm sú bị phơi nhiễm với IHHNV (Hình 3.27).
Hình 3.27. Tôm sú sau 40 ngày phơi nhiễm IHHNV.
Biểu hiện triệu chứng điển hình do IHHNV như vỏ có đốm trắng, vàng.
Các biểu hiện bệnh do IHHNV trên tôm sú nuôi quan sát được ở giai đoạn tiền trưởng thành như: xuất hiện các đốm trắng, vàng trên lớp biểu bì, nhất là trên giáp ở đầu ngực, phiến vỏ nối giữa lưng và bụng, đuôi và đầu chủy. Phần vỏ ở đuôi và phần đỉnh đầu xuất hiện đốm vàng. Ở tôm bị bệnh IHHNV cấp tính các đốm trắng, vàng chiếm ưu thế và lan rộng ra toàn thân. Các đốm trắng, vàng thường tập trung nhiều ở vùng giáp đầu ngực. Các tuyến mắt, râu, chân bò và chân bơi cũng ngã màu vàng (Hình 3.28).
Hình 3.28. Tôm sú bị bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu cấp tính.
Triệu chứng dị dạng biểu bì, phát triển không đều (RSD) cũng được phát hiện trong thực nghiệm khi tôm sú phơi nhiễm với IHHNV trong 50 ngày. Chủy của tất cả các cá thể trong bầy đàn đều ngã sang màu vàng. Các tuyến mắt, râu, chân bò và chân bơi trở nền sần sùi. Xuất hiện một số cá thể tôm sú có chủy bị
Chương 3. Kết quả - Bàn luận Phạm Văn Hùng
- 106 -
biến dạng và phát triển lệch về một bên (3.29). Tuy nhiên tỷ lệ cá thể có chủy biến dạng chiếm tỷ lệ thấp trong bầy đàn nuôi thực nghiệm. Một số cá thể tôm có kích thước khá nhỏ so với đồng loại, vỏ của một một số cá thể tôm trở nên nhạt và mềm hơn (Hình 3.30).
Hình 3.29. Tôm sú nuôi bị bệnh cấp tính do IHHNV.
Cá thể bên dưới có chủybị biến dạng lệch về một bên (mũi tên).
Hình 3.30. Hình dạng tôm bị nhiễm IHHNV sau 50 ngày phơi nhiễm.
Xuất hiện nhiều cá thể có kích thước nhỏ hơn (mũi tên đen), một số cá thể có màu nhạt hơn và vỏ trở nên mềm hơn so với đồng loại (mũi tên trắng).
Theo nghiên cứu của Lightner và cộng sự (1983) [35 và 36], Bondad và cộng sự (2001) [19] quan sát trên tôm xanh Thái Bình Dương P. stylirostris bị nhiễm IHHNV, thường xuất hiện các đốm trắng hoặc vàng trên lớp biểu bì, nhất là ở vị trí nối ở các phiến dọc theo các đốt bụng, làm cho tôm có hình dạng lốm
Chương 3. Kết quả - Bàn luận Phạm Văn Hùng
- 107 -
Nghiên cứu virus IHHNV (Infectious Hypodermal and Haematopoietic Necrosis Virus) trên tôm sú
đốm. Các đốm này sẽ nhạt dần và chuyển thành màu xanh khi tôm sắp chết [32].
Còn theo Kalagayan (1991) [28], Brock (1994) [21] và Lightner (1996) [32], RDS là hình thức bệnh mạn tính xuất hiện ở P. vannamei là do IHHNV gây ra.
Tính nghiêm trọng và sự phổ biến của RDS trong các quần thể tôm P. vannamei ở giai đoạn còn nhỏ hoặc trưởng thành có liên quan đến tôm ở giai đoạn ấu trùng hoặc hậu ấu trùng giai đoạn sớm bị nhiễm virus này. Ở đàn tôm nuôi P.
stylirostris và P. monodon cũng xuất hiện các triệu chứng RDS. Bệnh RDS làm chủy cong về một bên từ 45° đến 90° về phía bên trái hoặc bên phải hoặc làm biến dạng chủy. Đốt thứ sáu, râu bị sần xùi, lớp biểu bì ráp và xuất hiện các biến dạng khác trên lớp biểu bì. Quần thể tôm non khi bị bệnh RDS sẽ phát triển không đều và xuất hiện nhiều cá thể tôm có kích thước nhỏ hơn so với mong đợi. Còn theo nhóm nghiên cứu của Primavera và cộng sự (2000) [46], ở tôm sú có hiện tượng tôm ngả sang màu xanh, dấu hiệu biến dạng chủy ở tôm sú xảy ra chậm hơn so với tôm thẻ chân trắng, quan sát được ở những tôm có kích thước lớn.
Khi nghiên cứu bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan tạo biểu mô do IHHNV gây ra cho tôm P. stylirostris, Bell và cộng sự (1984 và 1987) [15 và 16]
đã phát hiện IHHNV thường gây bệnh cấp tính và làm tôm non chết ở tỷ lệ rất cao.
Nếu ấu trùng và hậu ấu trùng ở giai đoạn sớm bị nhiễm theo đường dọc thì không biểu hiện bệnh. Nhưng ở giai đoạn 35 ngày tuổi trở đi sẽ xuất hiện các biểu hiện lâm sàng khá rõ nét và theo sau là gây chết. Trong trường hợp tôm non bị nhiễm IHHNV theo đường ngang thì thời gian ủ bệnh và mức độ nghiêm trọng của bệnh có phần phụ thuộc vào kích cỡ và độ tuổi của tôm. Đối với tôm non giai đoạn sớm luôn bị nhiễm nghiêm trọng, nhưng đối với tôm trưởng thành bị nhiễm virus này hiếm khi biểu hiện bệnh hoặc gây chết.
3.5.2.1. Bệnh lý bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan tạo biểu mô biểu hiện ở mô
Chương 3. Kết quả - Bàn luận Phạm Văn Hùng
- 108 -
Bệnh lý bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan tạo biểu mô biểu hiện ở mô được phát hiện sau 21 ngày tôm nuôi phơi nhiễm với IHHNV. Khi tiến hành nhuộm H&E các mô có nguồn gốc từ ngoại bì, tế bào bị bệnh xuất hiện thể vùi dạng cowdry type A (CAIs). Đặc điểm điển hình của các mô bị bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu có các thể vùi ưa eosin (sậm màu do hematoxylin và eosin) và các thể vùi này thường có quầng bao quanh, xung quanh thể vùi là vòng nhiễm sắc nằm ngoài, nhân của các tế bào bị nhiễm trương to hơn so với mẫu đối chứng (Hình 3.31, 3.32 và 3.33).
Hình 3.31. Tôm sú nuôi đối chứng không nhiễm IHHNV.
Ảnh chụp dưới kính vi quang học độ phóng đại 1000 lần.
Hình 3.32. Tôm sú bị bệnh do IHHNV.
(a): lát cắt ngang ăng ten xuất hiện các thể vùi bao xung quanh là quầng nhạt màu, bên ngoài là gờ nhiễm sắc, nhân trương to và sậm màu. Dấu hiệu đặc trưng do nhiễm IHHNV; (b): lát cắt ngang đầu có 8 tế bào xếp thành 2 dãy xuất hiện thể vùi dạng CAIs nhân trương to và sậm màu do H&E, điển hình cho bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu (mũi tên). Ảnh chụp dưới kính hiển vi quang họcở độphóngđại 1000 lần.
Chương 3. Kết quả - Bàn luận Phạm Văn Hùng
- 109 -
Nghiên cứu virus IHHNV (Infectious Hypodermal and Haematopoietic Necrosis Virus) trên tôm sú
Hình 3.33. Lát cắt ngang tuyến râu và đuôi của tôm bị nhiễm IHHNV. Ảnh chụp dưới kính hiển vi quang học độ phóng đại 1000 lần, vật kính nhúng chìm. (a và b): lát cắt ngang tuyến râu; (c và d): lát cắt ngang đuôi tôm sú trưởng thành bị nhiễm IHHNV, dưới lớp biểu bì xuất hiện nhiều tế bào có thể vùi dạng CAIs nhân trương to, ưa eosin (mũi tên chỉ là vị trí tế bào bị bệnh bắt màu sậm). Thể vùi có đặc điểm điển hình cho chẩn đoán bệnh do IHHNV.
IHHNV được phát hiện trong bảy bộ phận của tôm sú nuôi thực nghiệm cảm nhiễm. Các bộ phận có những biểu hiện điển hình bệnh do IHHNV được phát hiện gồm chủy, tuyến râu, đầu mang, chân bơi, chân bò, đuôi, dây thần kinh bên của tôm (Bảng 3.10).
Chương 3. Kết quả - Bàn luận Phạm Văn Hùng
- 110 -
Bảng 3.10. Kết quả phân tích các bộ phận của tôm nuôi sau khi phơi nhiễm với IHHNV bằng phương pháp PCR và mô học.
Phương pháp
Chủy Mang Râu Chân bơi Chân bò
Cơ lưng Dây thần kinh bên
PCR + + + + + + +
Mô học + + + + + + +
Theo nghiên cứu của Gilles Fédière [25], hầu hết virus thuộc nhóm Densovirus khi xâm nhiễm vào vật chủ thì gây thương tổn chính ở nhân các tế bào bị nhiễm. Triệu chứng điển hình thường gặp là nhân trương to nhanh và trở nên sậm màu do ưa eosin. Còn theo Lightner [30 và 32], khi xét nghiệm mô học trên tôm P. stylirostris bị nhiễm IHHNV, xuất hiện thể vùi nội bào ưa eosin (thể vùi dạng Cowdry type A hay còn gọi là CAIs), các thể vùi thường có nhân trương to là đặc trưng bệnh do IHHNV xâm nhiễm và gây nên.
Kết quả thực nghiệm cảm nhiễm một lần nữa cho thấy quy trình phát hiện IHHNV trên tôm với mồi 196F/R vừa được xây dựng hoàn toàn đảm bảo độ tin cậy. Vì các kết quả phân tích bằng PCR thu nhận từ thí nghiệm đối chứng đều âm tính với IHHNV. Kết quả phát hiện bệnh do IHHNV thu nhận được từ phương pháp xét nghiệm mô học và quan sát thay đổi về hình thái trên tôm sú nuôi trong thực nghiệm cảm nhiễm đều cho kết quả dương tính với phương pháp PCR vừa được xây dựng.
Trong điều kiện thực nghiệm cảm nhiễm, thời gian IHHNV xâm nhiễm vào tôm sú nuôi là 7 ngày, thời gian ủ bệnh trong cơ thể vật chủ là 21 ngày. Hay biểu hiện triệu chứng bệnh lý bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan tạo biểu mô được phát hiện ở mô là sau 21 ngày khi tôm sú bị phơi nhiễm với IHHNV. Triệu chứng bệnh lý điển hình do IHHNV quan sát được bằng mắt thường là sau 40 ngày tôm sú nuôi được phơi nhiễm với IHHNV.
Chương 3. Kết quả - Bàn luận Phạm Văn Hùng
- 111 -
Nghiên cứu virus IHHNV (Infectious Hypodermal and Haematopoietic Necrosis Virus) trên tôm sú