CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Thu nhận tôm bệnh và kiểm chứng bằng phương pháp PCR
Thu nhận tôm sú bệnh nhiễm IHHNV phục vụ cho giải trình tự và thực nghiệm cảm nhiễm.
2.1.2. Thiết bị chính
Gồm tủ đông sâu MDF – U32V, máy ly tâm lạnh MIKRO 22R, buồng thao tác PCR LN090, máy luân nhiệt PTC – 200, bộ điện di POWER PAC UNIVERSAL, thiết bị đọc gel GELDOC UNIVERSAL HOOD II.
2.1.3. Vật liệu
Tôm sú được thu thập ở 5 tỉnh ĐBSCL là Bạc Liêu, Cà Mau, Sóc Trăng, Kiên Giang và Trà Vinh.
2.1.4. Hóa chất, môi trường
2.1.4.1. Hóa chất dùng cho phản ứng PCR
− Đệm ly trích DNA IHHNV: dung dịch chiết tách DNA gồm 50 mM Tris hydroxymethyl-aminomethane; 1mM Ethylenediaminetetra acetic acid (EDTA); 500 mM Sodium chloride; 1 % Sodium dodecyl sulphate (SDS) và 10 àg/ml Proteinase K; nước cất vừa đủ 1000 ml; pH= 8,0.
− Ðệm TE: gồm 10 mM Tris-HCl (pH = 8,0) và 1 mM EDTA.
− Thành phần phản ứng PCR
+ Đệm PCR (Fermentas): gồm 0,05 μl taq DNA polymerase; 4 mM MgCl2; 0,4 mM của mỗi dNTP và đệm phản ứng vừa đủ.
+ Thành phần phản ứng PCR: 25 μl đệm PCR đậm độ 1 lần; 1 μl hỗn hợp mồi 309F/R (ở nồng độ 0,1 μM); 1 μl hỗn hợp mồi M831F/R (ở nồng độ 1 μM) và 20 μl dH2O.
2.1.4.2. Mồi
Cặp mồi 309F/R là cặp mồi đã được Tang và cộng sự chứng minh là đặc hiệu chỉ phát hiện IHHNV. Mồi MG831F/R là cặp mồi đặc hiệu chỉ phát hiện trình tự
Chương 2. Vật liệu – Phương pháp Phạm Văn Hùng
DNA có trong bộ gen tôm sú tương đồng với IHHNV (DQ228358). Vì vậy hai cặp mồi 309F/R và MG831F/R [44 và 55] được sử dụng để lựa chọn mẫu tôm sú chỉ nhiễm IHHNV và không nhiễm trình tự DQ228358. Mẫu tôm sú chỉ nhiễm IHHNV được sử dụng để làm mẫu cho giải trình tự và thực nghiệm cảm nhiễm.
Bảng 2.1. Mồi sử dụng cho phản ứng PCR
Mồi Trình tự
Sản
phẩm GenBank 309F 5’-TCCAACACTTAGTCAAAACCAA-3’
309R 5’-TGTCTGCTACGATGATTATCCA-3’ 309 bp AF218266.2 [44 và 55]
MG831F 5’-TTGGGGATGCAGCAATATCT-3’
MG831R 5’-TTGGGGATGCAGCAATATCT-3’ 831 bp DQ228358.1 [44 và 55]
Deca20a2 5’-ACTTCCCCCGGAACCCAAAGACT-3’
Deca20s9 5’-GGGGGCATTCGTATTGCGA3’ 240 bp CSIRO, 2008 [10]
Hình 2.1. Sơ đồ minh họa vị trí bắt cặp của cặp mồi 309F/R trên bộ gen IHHNV (AF218266.2) và cặp mồi MG831F/R trên trình tự DNA tương đồng với IHHNV (DQ228358).
Cặp mồi Deca 20a2/20s9 là mồi đặc hiệu dùng để phát hiện gen của nhóm
Chương 2. Vật liệu – Phương pháp Phạm Văn Hùng
giáp xác mười chân đã được tổ chức CSIRO– Úc công bố vào năm 2008 [10], gen này được xem như là gen nội chuẩn được sử dụng trong quy trình phân tích IHHNV. Chi tiết trình tự và vị trí bắt cặp của mồi 309F/R trên bộ gen IHHNV và cặp mồi MG831F/R trên trình tự DQ228358 được mô tả ở Bảng 2.1 và Hình 2.1.
Nồng độ của mồi sử dụng trong phân tích được pha loãng thành 25 mM trong dung dịch đệm TE. Ðệm TE có thành phần như sau: 10 mM Tris-HCl (pH = 8,0) và 1 mM EDTA.
2.1.4.3. Thang DNA
Thang DNA có kích thước 100 -1000 bp của hãng Fermentas được sử dụng trong điện di nhằm xác định kích thước của sản phẩm PCR (Hình 2.2).
Hình 2.2. Thang DNA 100 – 1000 bp 2.1.5. Phương pháp tiến hành
Các mẫu tôm sú nuôi ở các tỉnh ĐBSCL như: Bến Tre, Cà Mau, Kiên Giang, Sóc Trăng và Trà Vinh được thu thập để thu nhận nguồn DNA IHHNV. Mỗi tỉnh thu thập khoảng 30 mẫu, các mẫu tôm sú sau khi thu thập được cho vào túi PE, có ghi nhãn, bảo quản trong đá lạnh và được chuyển nhanh về phòng thí nghiệm để phân tích IHHNV. Đối với mẫu tôm dùng để phân tích mô học được cố định trong dung dịch Davidson’s và bảo quản trong dung dịch có 50 – 70 % ethyl alcohol. Các mẫu tôm được phân tích trên phương pháp mô học trình bày cụ thể tại Mục 2.5.5.4.
Chương 2. Vật liệu – Phương pháp Phạm Văn Hùng
Các bước của phương pháp PCR được tiến hành như sau:
− Ly trích DNA: mang, chân bơi hoặc chân bò của tôm được nghiền với đệm ly trích, ủ và ly tâm để loại bỏ tủa, lấy dịch nổi để tủa trong ethanol. Ly tâm, lấy phần tủa làm khô và hòa tan với đệm DEPC hoặc TE.
− Mồi khuếch đại IHHNV: cặp mồi 309F/309R được sử dụng để phát hiện IHHNV gây bệnh và cặp mồi MG831F/MG831 dùng để khuếch đại trình tự DQ228358. Vì vậy hai cặp mồi 309F/R và MG831F/R được sử dụng để lựa chọn mẫu tôm chỉ nhiễm IHHNV để sử dụng cho giải trình tự và thực nghiệm cảm nhiễm.
− Điều kiện luân nhiệt như sau: biến tính ở 95 oC trong 5 phút, khuếch đại trong 35 chu kỳ (ở 95 oC trong 30 giây, 55 oC trong 30 giây, ở 72 oC trong 1 phút) và 1 chu kỳ ở 72 oC trong 5 phút.
− Điện di: ở hiệu điện thế 100 đến 120 V, trong 30 phút.
− Lựa chọn tôm sú chỉ nhiễm IHHNV: sau khi phân tích, mẫu tôm cho kết quả dương tính IHHNV trên cả hai phương pháp mô học và PCR (chỉ xuất hiện vạch 309 bp, không xuất hiện vạch 831 bp) được lựa chọn để làm khuôn khuếch đại DNA cho tạo dòng, giải trình tự từng phần bộ gen IHHNV và sử dụng cho thực nghiệm cảm nhiễm.