CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.4. Xây dựng phương pháp phân tích IHHNV
3.4.2. Xác định các điều kiện phản ứng PCR đối với mồi 196F/R
Để đánh giá khả năng mồi 196F/R được lựa chọn có đáp ứng được các điều kiện phản ứng PCR. Sau thiết kế, trình tự mồi được lấy từ hãng IDT, Hoa Kỳ được sử dụng để tiến hành khảo sát các điều kiện phản ứng PCR bao gồm: xác định nhiệt độ bắt cặp tối thích của mồi, khảo sát nồng độ tối ưu của mồi, khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Mg2+ lên phản ứng PCR và xác định tính chuyên biệt của mồi. Kết quả thu nhận như sau:
3.4.2.1. Kết quả khảo sát nhiệt độ bắt cặp tối thích của mồi
Thí nghiệm nhằm xác định nhiệt độ bắt cặp tối thích của mồi được tiến hành ở dãy nhiệt độ từ 55 oC đến 59 oC với khoảng cách 1 oC. Ở khoảng nhiệt độ này, mồi có khả năng bắt cặp và khuếch đại đoạn DNA có kích thước 196 bp được thể hiện trên bảng điện di là băng sáng rõ nét. Tuy nhiên ở nhiệt độ 58 oC, đoạn DNA được khuếch đại cho kết quả rõ và đẹp nhất, chứng tỏ khả năng bắt cặp tốt nhất (vị trí 10, 11 và 12; Hình 3.16). Từ kết quả thực nghiệm này chúng tôi chọn giá trị nhiệt độ ở 58 oC cho thí nghiệm tiếp theo để đánh giá mức độ đặc hiệu của mồi.
Hình 3.16. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhằm khảo sát nhiệt độ bắt cặp tối thích của mồi.
M: thang DNA 100 – 1000 bp; (-): mẫu kiểm chứng âm (tôm sạch bệnh từ Đại học Arizona); (+): mẫu kiểm chứng dương (tôm nhiễm IHHNV từ Đại học Arizona, ở 58 oC); 1 – 15: thí nghiệm được tiến hành ở khoảng nhiệt độ từ 55
oC đến 59 oC.
Chương 3. Kết quả - Bàn luận Phạm Văn Hùng
- 90 -
Như vậy điều kiện luân nhiệt cho PCR sử dụng mồi 196F/R được thiết lập như sau: 1 chu kỳ ở 95 oC/ 5 phút, 35 chu kỳ ở (95 oC/30 giây, 58 oC /30 giây, 72
oC/ 1 phút) và 1 chu kỳ ở 72 oC/ 5 phút.
3.4.2.2. Kết quả khảo sát nồng độ mồi
Nhằm xác định nồng độ mồi thích hợp cho phản ứng PCR. Thí nghiệm được tiến hành trong khoảng nồng độ của mồi từ 0,1 μM đến 0,5 μM. Kết quả thu nhận được trong khoảng nồng độ từ 0,1 μM - 0,5 μM của mồi đều cho kết quả tốt với phản ứng PCR và không có sự khác biệt đáng kể (Hình 3.17). Vì vậy nồng độ mồi xuôi và mồi ngược được chọn là 0,1 μM cho mỗi phản ứng PCR.
Hình 3.17. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhằm xác định ảnh hưởng của nồng độ mồi lên phản ứng PCR.
M: thang DNA 100 – 1000 bp; (-): mẫu kiểm chứng âm IHHNV; (+): mẫu kiểm chứng dương IHHNV; 1-15: nồng độ mồi từ 0,1 μ m đến 0,5 μ m.
3.4.2.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Mg2+
Để xem xét khả năng ảnh hưởng của nồng độ Mg2+ lên phản ứng PCR. Thí nghiệm được tiến hành trong khoảng nồng độ MgCl2 từ 1 – 2 mM. Kết quả cho thấy trong khoảng nồng độ MgCl2 từ 1-2 mM đều không ảnh hưởng đến kết quả phản ứng PCR (Hình 3.18).
Chương 3. Kết quả - Bàn luận Phạm Văn Hùng
- 91 -
Nghiên cứu virus IHHNV (Infectious Hypodermal and Haematopoietic Necrosis Virus) trên tôm sú
Hình 3.18. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhằm xác định ảnh hưởng của nồng độ MgCl2 lên phản ứng PCR.
M: thang DNA 100 – 1000 bp; (-): mẫu kiểm chứng âm IHHNV; (+): mẫu kiểm chứng dương IHHNV; 1-18: thí nghiệm ở nồng độ MgCl2 từ 1 mM đến 2 mM
3.4.2.4. Xác định tính chuyên biệt của mồi 196F/R
a. Khảo sát khả năng bắt cặp để khuếch đại chéo với các virus khác Mục tiêu nhằm đánh giá mồi 196F/R có khả năng bắt cặp để khuếch đại với các virus thường gặp trên tôm sú như WSSV và MBV. Thí nghiệm được tiến hành phân tích PCR trên 10 mẫu tôm sú nhiễm IHHNV, 5 mẫu tôm sú nhiễm WSSV và 5 mẫu tôm sú nhiễm MBV (Kết quả lựa chọn mẫu tôm sú dương tính với WSSV và mẫu tôm sú dương tính với MBV được trình bày chi tiết xem Phụ lục 6). Kết quả thu được như sau: đối với 10 mẫu tôm sú nhiễm IHHNV, trên bảng điện di xuất hiện đoạn DNA có kích thước 196 bp. Ngược lại, đối với 5 mẫu tôm sú nhiễm virus WSSV và 5 mẫu tôm sú nhiễm virus MBV không có đoạn DNA nào xuất hiện trên bảng điện di. Như vậy mồi 196F/R không bắt cặp và khuếch đại chéo virus WSSV và virus MBV (Hình 3.19).
Chương 3. Kết quả - Bàn luận Phạm Văn Hùng
- 92 -
Hình 3.19. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhằm xác định độ đặc hiệu của mồi 196F/R
M: thang DNA 100 – 1000 bp; (-): mẫu kiểm chứng âm IHHNV; (+): mẫu kiểm chứng dương IHHNV; (A). 1: mẫu tôm nhiễm IHHNV; 2, 3 và 4:
mẫu tôm nhiễm IHHNV từ thực nghiệm cảm nhiễm; 5 và 6: mẫu tôm ở Bạc Liêu nhiễm IHHNV đã qua giải trình tự; 7, 8: mẫu tôm ở Cà Mau nhiễm IHHNV đã qua giải trình tự; 9: mẫu tôm ở Sóc Trăng nhiễm IHHNV; 10: mẫu tôm sú ở Trà Vinh nhiễm IHHNV; (B). 1 – 5: mẫu tôm sú nhiễm WSSV thu thập ở ĐBSCL; 6-10: mẫu tôm sú nhiễm MBV thu thập ở ĐBSCL.
b. Khảo sát khả năng khuếch đại chéo trình tự DQ228358
Mục tiêu xem xét khả năng bắt cặp để khuếch đại trình tự DNA tương đồng với IHHNV có trong bộ gen trên tôm sú của mồi 196F/R. Thí nghiệm được tiến hành phân tích PCR trên 10 mẫu tôm sú thu thập ở Trà Vinh và Cà Mau có trình tự DQ228358 và 10 mẫu tôm sú nhiễm IHHNV. Phương pháp PCR với hai cặp mồi 196F/R và 831F/R được sử dụng để phát hiện trình tự DQ228358.
Chương 3. Kết quả - Bàn luận Phạm Văn Hùng
- 93 -
Nghiên cứu virus IHHNV (Infectious Hypodermal and Haematopoietic Necrosis Virus) trên tôm sú
Hình 3.20. Kết quả điện di sản phẩm PCR của thí nghiệm xác định khả năng khuếch đại trình tự DQ228358 của mồi 196F/R.
(a). Mồi 196F/R; M: thang DNA 100 – 1000 bp; (-) mẫu kiểm chứng âm IHHNV; (+): mẫu kiểm chứng dương IHHNV; (b). Mồi 831F/R; M:
thang DNA; (-): mẫu kiểm chứng âm DQ228358; (+): mẫu kiểm chứng dương DQ228358; 1 – 5: tôm sú nuôi ở Trà Vinh có trình tự DQ228358; 6 – 10: tôm sú nuôi ở Cà Mau có trình tự DQ228358.
Kết quả phân tích trên 10 mẫu tôm có trình tự DQ228358, quy trình phân tích PCR với mồi 831F/R đều xuất hiện đoạn DNA có kích thước 831 bp trên bảng điện di. Ngược lại khi phân tích bằng quy trình sử dụng mồi 196F/R thì không phát hiện xuất hiện vạch 196 bp (Hình 3.20). Như vậy cặp mồi 196F/R không bắt cặp để khuếch đại trình tự DQ228358. Việc xác định mồi 196F/R không bắt cặp khuếch đại trình tự DQ228358 là yếu tố rất quan trọng trong đánh giá tính đặc hiệu của mồi vì mức tương đồng giữa DQ228358 với IHHNV là 87 %.
c. Phân tích sản phẩm PCR
Nhằm đánh giá mức độ tương đồng của sản phẩm PCR so với bộ gen
Chương 3. Kết quả - Bàn luận Phạm Văn Hùng
- 94 -
IHHNV-VN và so với các bộ gen IHHNV khác. Sản phẩm PCR của mồi 196F/R được giải trình tự. Mức độ tương đồng tối đa của đoạn trình tự sản phẩm PCR so với trình tự DNA mã hóa cho protein khởi đầu sao chép II là 97 %, so với một phần bộ gen IHHNV – VN là 100 % (với giá trị E là 10-68) và từ 96 đến 100 % khi so sánh với các bộ gen IHHNV khác thu thập trên Ngân hàng gen. Hơn nữa khi tìm kiếm trên dữ liệu ngân hàng gen thế giới, trình tự nt sản phẩm PCR chỉ bắt cặp với các trình tự nt của các bộ gen IHHNV (Chi tiết được trình bày tại Phụ lục 7 và 8). Như vậy có thể nói mồi 196F/R hoàn toàn đặc hiệu để phát hiện IHHNV.