CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.4. Xây dựng phương pháp phát hiện IHHNV
Xây dựng phương pháp phát hiện IHHNV đáp ứng các yêu cầu về tính chuyên biệt và độ nhạy, đồng thời thỏa mãn các tiêu chí xác nhận giá trị hiệu lực để phương pháp có thể sử dụng trong các phòng xét nghiệm bệnh tôm.
Chương 2. Vật liệu – Phương pháp Phạm Văn Hùng
2.4.2. Vật liệu
Chi tiết mẫu dùng trong để xây dựng phương pháp được liệt kê ở Bảng 2.3.
Bảng 2.3. Mẫu tôm sử dụng để xây dựng phương pháp phân tích IHHNV
TT Tên mẫu Đặc điểm Nơi thu thập Năm
1 Vật liệu chuẩn Tôm sạch bệnh, không có
IHHNV Đại học Arizona – Hoa
Kỳ 2008
2 Vật liệu chuẩn Tôm sú nhiễm IHHNV gây
bệnh Đại học Arizona – Hoa
Kỳ 2008
3 Mẫu tôm sú Xác định qua giải trình tự bộ
gen IHHNV Bạc Liêu 2009
4 Tôm sú Nhiễm IHHNV Kiên Giang 2009
5 Tôm sú Nhiễm IHHNV Kiên Giang 2009
6 Tôm sú Nhiễm IHHNV qua thực nghiệm cảm nhiễm
Trại giống Minh Thuận – Cần Thơ
2009
7 Tôm sú Nhiễm IHHNV Sóc Trăng 2009
8 Tôm sú Nhiễm IHHNV Bến Tre 2008
9 Tôm sú Có trình tự DNA tương
đồng với IHHNV Duyên Hải - Trà Vinh 2009 10 Tôm sú Có trình tự DNA tương
đồng với IHHNV Cà Mau 2010
2.4.3. Thiết bị chính
Gồm một số thiết bị chính như sau: máy ly tâm lạnh MIKRO, block nhiệt khô BH-1/DIG, tủ đông sâu MDF – U32V, máy luân nhiệt PTC – 200, bộ điện di POWER PAC UNIVERSAL và thiết bị đọc gel GELDOC UNIVERSAL HOOD II.
2.4.4. Phương pháp tiến hành 2.4.4.1. Tách chiết DNA
DNA của IHHNV được ly trích bằng cách nghiền mang, chân bơi hoặc chân bò với dung dịch chiết tách DNA. Quá trình tách chiết tham khảo theo quy trình của Lightner và cộng sự [32].
Chương 2. Vật liệu – Phương pháp Phạm Văn Hùng
2.4.4.2. Thiết kế mồi
Bộ gen IHHNV phân lập tại Việt Nam sẽ được sử dụng để thiết kế mồi. Đưa khung đọc mở đã xác định có các trình tự bảo tồn vào phần mềm primer3, lựa chọn đoạn mồi đặc hiệu khuếch đại đoạn DNA thuộc khung đọc mở này. Mồi lựa chọn sau thiết kế sẽ được sử dụng để xác định các điều kiện phản ứng PCR, tính chuyên biệt của mồi và xác nhận giá trị sử dụng.
2.4.4.3. Xây dựng phản ứng PCR xét nghiệm IHHNV sử dụng cặp mồi được thiết kế
Quy trình PCR được tiến hành qua các thực nghiệm như xác định nhiệt độ bắt cặp tối ưu của mồi, nồng độ mồi tối ưu và ảnh hưởng của nồng độ Mg2+ lên phản ứng PCR. Ngoài ra còn tiến hành các thí nghiệm để xác định độ đặc hiệu như: thí nghiệm xác định khả năng phân biệt của mồi đối với các mẫu có DNA của các virus khác nhau và thí nghiệm xác định khả năng bắt cặp để khuếch đại trình tự DQ228358. Mặc khác trình tự sản phẩm PCR còn được sử dụng để phân tích so sánh đánh giá độ tương đồng với đại diện bộ gen IHHNV của Việt Nam và các đại diện IHHNV khác.
− Xác định nhiệt độ bắt cặp tối ưu: mục đích của thí nghiệm này là tìm nhiệt độ bắt cặp tối ưu để cho ra sản phẩm PCR đặc hiệu với mồi đã thiết kế, khi điện di trên gel agarose chỉ có duy nhất một vạch sáng có kích thước tương ứng với mồi đã thiết kế. Thí nghiệm được tiến hành ở các điều kiện nhiệt độ: 55 oC, 56
oC, 57 oC, 58 oC và 59 oC khi thực hiện phản ứng PCR với mẫu tôm có IHHNV. Sau khi xác định được nhiệt độ bắt cặp tối thích, điều kiện nhiệt độ cho PCR như sau: 1 chu kỳ ở 95 oC/ 5 phút, 35 chu kỳ ở (95 oC/30 giây, nhiệt độ bắt cặp tối thích /30 giây, 72 oC/ 1 phút), 1 chu kỳ ở 72 oC/ 5 phút.
− Xác định nồng độ mồi tối ưu: mồi dùng trong phản ứng được pha loãng trong dãy nồng độ từ 0,1 ng – 0,5 ng nhằm xác định nồng độ tối ưu cho phản ứng.
− Xác định ảnh hưởng của nồng độ Mg2+: ảnh hưởng của nồng độ Mg2+ được
Chương 2. Vật liệu – Phương pháp Phạm Văn Hùng
xác định trong khoảng 1 – 2 mM.
− Độ đặc hiệu: thí nghiệm được tiến hành với 30 phản ứng PCR gồm 10 mẫu tôm nhiễm IHHNV, 5 mẫu tôm nhiễm WSSV, 5 mẫu tôm nhiễm MBV và 10 mẫu tôm sú có trình tự DQ228358 nhằm xác định khả năng phân biệt của mồi với các mẫu có DNA của các virus khác nhau.
− Phân tích sản phẩm PCR: trình tự nt của sản phẩm PCR được sử dụng để so sánh mức độ tương đồng với các trình tự bảo tồn của bộ gen IHHNV, với trình tự bộ gen IHHNV phân lập trên tôm sú nuôi tại Việt Nam và các bộ gen IHHNV thu thập trên thế giới.
2.4.4.4. Xác nhận giá trị hiệu lực phương pháp
Để xác nhận giá hiệu lực của mồi cũng như quy trình phân tích, một số tiêu chí được nêu trong Chương 2. Nguyên tắc và phương pháp đánh giá hiệu lực các phép thử và chẩn đoán bệnh thú y, yêu cầu tiêu chí và cách thức phê duyệt phương pháp phân tích tác nhân gây bệnh bằng kỹ thuật PCR của OIE được lựa chọn để xác nhận giá trị hiệu lực của phương pháp [44]. Cụ thể các tiêu chí được lựa chọn đánh giá như sau:
− Độ ổn định: xác định độ lặp lại của phương pháp nhằm đánh giá sự ổn định của các bước ly trích cũng như khả năng khuếch đại PCR ở nhiều lần thực nghiệm khác nhau. Độ ổn định được thực hiện trong 4 ngày phân tích với 20 lần chạy PCR trên cùng một mẫu.
− Giới hạn phát hiện: thí nghiệm được tiến hành nhằm xác định độ nhạy của quy trình phân tích. Thí nghiệm được thực hiện trên DNA dạng plasmid tổng hợp (do công ty Nam Khoa cung cấp), tiến hành phân tích PCR trên nhiều nồng độ plasmid khác nhau. Mỗi nồng độ thực hiện lặp lại 20 lần. Độ nhạy được xác định ở nồng độ thấp nhất có tất cả các kết quả đều dương tính.
− Sử dụng vật liệu chuẩn: tôm sạch bệnh không nhiễm IHHNV và tôm nhiễm IHHNV do Đại học Arizona cung cấp được sử dụng làm nguồn vật liệu chuẩn
Chương 2. Vật liệu – Phương pháp Phạm Văn Hùng
cho phân tích PCR.
− So sánh với phương pháp PCR khác: quy trình phát hiện IHHNV đã xây dựng được sử dụng để so sánh với quy trình phân tích có sử dụng các cặp mồi 389F/R, 392F/R và 309F/R đã được công bố trong sổ tay phương pháp của OIE để đánh giá ưu và nhược điểm của phương pháp đã xây dựng.
− Thử nghiệm với mồi phát hiện gen nội chuẩn: thí nghiệm được tiến hành với cặp mồi deca20a2/20s9 [10] dùng để phát hiện gen nội chuẩn nhằm kiểm soát hiện tượng âm tính giả do sai sót trong quá trình phân tích.
− Thử nghiệm liên phòng: quy trình phân tích đã được xây dựng sẽ tham gia thử nghiệm liên phòng với các phòng thí nghiệm khác. Trong đó phòng thí nghiệm của Đại học Arizona vừa là phòng thí nghiệm chuẩn bị mẫu chuẩn (gồm mẫu tôm sạch bệnh và nhiễm IHHNV) vừa là phòng thí nghiệm trọng tài đánh giá kết quả của các phòng thí nghiệm tham gia liên phòng.