CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.5. Thực nghiệm cảm nhiễm
Xác định thời gian xâm nhiễm, triệu chứng bệnh lý bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan tạo biểu mô khi tôm sú bị phơi nhiễm với IHHNV.
2.5.2. Vật liệu
Tôm giống sạch bệnh, mẫu tôm sú chỉ nhiễm IHHNV.
2.5.3. Thiết bị chính
Hệ thống gồm có 6 bể nuôi 50 lít/ bể có kiểm soát, kính hiển vi quang học, máy xử lý mô tự động STP – 120, máy cắt mô HM – 310, bể điều nhiệt 25900, máy nhuộm mô tự động HMS 70, máy đúc mô tự động EC – 350.
2.5.4. Hóa chất
− Dung dịch cố định và bảo quản mẫu Davidson: thành phần cho 1000 ml gồm 330 ml ethyl alcohol 95 %; 220 ml formalin 100 %; 115 ml glacial acetic acid;
335 ml nước cất.
Chương 2. Vật liệu – Phương pháp Phạm Văn Hùng
− Hóa chất dùng để nhuộm mô (Harris Hematoxylin & Eosin): pha chế Harris’
hematoxylin trong 1000 ml nước cất gồm 5 g hematoxylin dạng tinh thể; 50 ml alcohol 100 %; 100 g amonium hay potassium nhôm; 2,5 g mercuric oxide.
Hòa tan hematoxylin trong cồn, muối nhôm trong nước cất đun nóng. Làm nguội và trộn hai dung dịch lại với nhau. Đun sôi, làm nguội và thêm mercuric oxid, gia nhiệt đến lúc gần sôi cho đến khi dung dịch ngã màu tía sậm. Làm lạnh nhanh. Mỗi 100 ml dung dịch thêm 2 – 4 ml glacial acid acetic.
− Dung dịch Eosin: gồm 100 ml dung dịch eosin (eosin Y 1 %); 10 ml dung dịch phloxine (phloxine B 1 %); 780 ml ethanol 95 %; 4 ml glacial acetic acid; acid – alcohol gồm 10 ml hydrochloric acid trong 1000 ml cồn 70 %.
− Dung dịch ammon: 3 ml ammonium hydroxide 28 % trong 1000 ml nước.
− Lithium carbonate bảo hòa: 1 g lithium carbonate trong 100 ml nước cất.
2.5.5. Phương pháp tiến hành
2.5.5.1. Lựa chọn nguồn tôm sạch bệnh
Lựa chọn tôm sú mẹ có nguồn gốc rõ ràng từ cơ sở nuôi tôm giống của công ty trách nhiệm hữu hạn Minh Thuận, tiến hành phân tích các chỉ tiêu WSSV, YHV, GAV, MBV, HPV, TSV và IHHNV cho kết quả âm tính. Tôm mẹ này dùng để sinh sản để lấy tôm con giai đoạn hậu ấu trùng. Sau đó nuôi đến lúc tôm có trọng lượng từ 0,05 g đến 0,1 g/con. Tiến hành phân tích PCR để xác định nguồn tôm không nhiễm virus WSSV, YHV, GAV, MBV, TSV và IHHNV. Đây được xem như là nguồn tôm sạch bệnh.
2.5.5.2. Lựa chọn tôm sú chỉ nhiễm IHHNV
Tiến hành thu thập và lựa chọn 5 kg tôm sú chỉ nhiễm IHHNV để làm nguồn thức ăn bổ sung cho quá trình nuôi thực nghiệm cảm nhiễm. Phương pháp PCR được sử dụng để lựa chọn các mẫu tôm nhiễm IHHNV, loại bỏ các mẫu tôm có trình tự DNA tương đồng với IHHNV và mẫu tôm nhiễm các virus WSSV, YHV, MBV, HPV và TSV.
Chương 2. Vật liệu – Phương pháp Phạm Văn Hùng
2.5.5.3. Thực nghiệm cảm nhiễm
Quá trình nuôi thực nghiệm cảm nhiễm tham khảo theo quy trình của Bonami và cộng sự 1990 [18], Lightner và cộng sự 1996 và 1998 [32 và 37].
Thực hiện nuôi cảm nhiễm trong bể nuôi 50 lít có kiểm soát, 120 cá thể tôm/ bể.
Nhiệt độ nước nuôi từ 25 – 28 oC, độ mặn từ 20 – 25 0/00, pH của nước là 8 – 8,12.
Thực nghiệm được tiến hành theo hai nhóm: (I): thí nghiệm đối chứng, gồm ba bể nuôi tôm chỉ cho ăn thức ăn viên. (II): thí nghiệm cảm nhiễm bằng cách cho ăn bổ sung tôm chỉ nhiễm IHHNV đã được xay nhuyễn và cắt lát mỏng. Quá trình thí nghiệm được lặp lại 3 lần theo các nghiệm thức ở Bảng 2.5, được tiến hành tại cơ sở ươm giống tôm sú của công ty Minh Thuận, quận Cái Răng, Tp. Cần Thơ.
Bảng 2.4. Bố trí thí nghiệm cảm nhiễm IHHNV trên tôm sú Nhóm thí
nghiệm
Tên thí nghiệm Cho ăn Lấy mẫu phân tích Đối chứng 1
Đối chứng 2 I
Đối chứng 3
Thức ăn viên, 4 lần/ ngày Cảm nhiễm 1
Cảm nhiễm 2 II
Cảm nhiễm 3
Cho ăn thức ăn viên và tôm nhiễm IHHNV, 4 lần/ ngày
Lấy 3 mẫu/bể sau khi nuôi ở các ngày thứ 0, 3, 7, 11, 15, 21, 30, 40 và 50 đem phân tích theo nội dung 2.5.5.4.
2.5.5.4. Phân tích sau cảm nhiễm
− Xác định khả năng xâm nhiễm của IHHNV: được xác định bằng phương pháp PCR với cặp mồi 196F/R.
− Xác định bệnh do IHHNV bằng phương pháp mô học: được tiến hành theo quy trình phân tích của Lightner và cộng sự [30 và 32] bao gồm các bước chính như sau:
+ Bước 1. Cố định và bảo quản mẫu trong Davidson’s: hậu ấu trùng cỡ lớn, tôm non và trưởng thành, tiêm chất cố định vào vị trí bên hông gan tụy, vùng trước gan tụy, vùng trước bụng và vùng sau bụng tôm còn sống. Cắt lớp vỏ cứng từ đốt bụng thứ 6 đến phần gai đầu chủy, chuyển
Chương 2. Vật liệu – Phương pháp Phạm Văn Hùng
các mẫu tôm vào dung dịch có 50 – 70 % ethyl alcohol và bảo quản lâu dài.
+ Bước 2. Các bộ phận của tôm sẽ tiến hành quan sát biểu hiện mô học:
chủy, tuyến râu, ăn ten, mang, chân bò, chân bơi, đuôi, tuyến dây thần kinh hông và cơ lưng (Hình 2.5).
Hình 2.5. Vị trí phân tích bệnh do IHHNV bằng kỹ thuật mô học.
+ Bước 3. Chuẩn bị đúc mô: loại bỏ ethyl alcohol, cắt đôi tôm theo chiều ngang từ phần sau đến phần nối của đầu và bụng. Loại bỏ 80 % phần ngoại biên của phụ bộ đầu.
+ Bước 4. Đúc mô: đúc paraffin và làm lạnh nhanh trên máy đúc mô.
+ Bước 5. Cắt mô: dày từ 3 – 5 μm.
+ Bước 6. nhuộm H&E: loại bỏ paraffin và hydrate hóa với nước, nhuộm Harris’ hematoxylin và eosin.
− Quan sát sự biến đổi về hình thái: theo dõi ảnh hưởng của IHHNV lên tôm sú bằng cách quan sát sự biến đổi về hình thái. Quan sát và ghi nhận thay đổi về màu sắc, hình dạng của vỏ giáp của các đốt bụng, giáp đầu ngực, các bộ phận như chủy, tuyến râu, ăng ten, chân bò, chân bơi và đuôi của tôm phơi nhiễm IHHNV so với tôm nuôi đối chứng.
Chương 2. Vật liệu – Phương pháp Phạm Văn Hùng