CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.4. Xây dựng phương pháp phân tích IHHNV
3.4.3. Xác nhận hiệu lực phương pháp PCR với mồi 196F/R
Một số tiêu chí được nêu tại Chương 2. Nguyên tắc và phương pháp đánh giá hiệu lực các phép thử và chẩn đoán bệnh thú y thủy sản. Yêu cầu tiêu chí và cách thức xác nhận giá trị hiệu lực phương pháp phân tích tác nhân gây bệnh bằng kỹ thuật PCR của OIE được sử dụng để xác nhận giá trị sử dụng của mồi cũng như xác nhận giá trị sử dụng của quy trình phân tích IHHNV. Các tiêu chí đánh giá gồm: độ ổn định của mồi, thử nghiệm trên mẫu chuẩn, xác định giới hạn phát hiện, so sánh với phương pháp PCR sử dụng các cặp mồi khác và sử dụng mồi nội chuẩn. Kết quả thí nghiệm lần lượt được trình bày như sau:
3.4.3.1. Khảo sát độ ổn định của quy trình phân tích
Nhằm xác định độ ổn định của quy trình phân tích PCR với mồi 196F/R. Thí nghiệm được tiến hành trong 20 lần phân tích trong 4 ngày trên cùng một mẫu.
Kết quả 20 lần thử trong bốn ngày trên cùng một tôm sú mẫu nhiễm IHHNV, cho thấy cả 20 lần chạy đều xuất hiện vạch 196 bp (Hình 3.21). Như vậy quy trình phân tích với mồi 196F/R là khá ổn định.
Chương 3. Kết quả - Bàn luận Phạm Văn Hùng
- 95 -
Nghiên cứu virus IHHNV (Infectious Hypodermal and Haematopoietic Necrosis Virus) trên tôm sú
Hình 3.21. Kết quả điện di sản phẩm PCR của thí nghiệm khảo sát độ ổn định của mồi 196F/R.
M: thang DNA 100 – 1000 bp; (-): mẫu kiểm chứng âm IHHNV; (+): mẫu kiểm chứng dương IHHNV; 1 – 20: mẫu nhiễm IHHNV từ thực nghiệm cảm nhiễm.
3.4.3.2. Xác định giới hạn phát hiện
Mục tiêu xem xét giới hạn phát hiện của quy trình phân tích IHHNV bằng kỹ thuật PCR với mồi 196F/R. Sử dụng DNA của IHHNV dạng tổng hợp của công ty Nam Khoa với nồng độ ban đầu là 100 bản sao. Thí nghiệm PCR được tiến hành ở các nồng độ 100, 75 và 50 bản sao DNA IHHNV. Sau phân tích thu nhận kết quả như sau: không phát hiện IHHNV ở nồng độ ở 50 và 75 bản sao. Ở nồng độ 100 bản sao, số lần phát hiện là 20/20 (Hình 3.22). Như vậy giới hạn phát hiện của quy trình phân tích với mồi 196F/R là 100 bản sao DNA IHHNV.
Chương 3. Kết quả - Bàn luận Phạm Văn Hùng
- 96 -
Hình 3.22. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhằm xác định giới hạn phát hiện.
M: thang DNA 100 – 1000 bp; (-): mẫu kiểm chứng âm IHHNV; (+): mẫu kiểm chứng dương IHHNV; 1- 20: mẫu phân tích IHHNV dạng plasmid tổng hợp ở 50, 75 và 100 bản sao.
3.4.3.3. Thử nghiệm trên vật liệu chuẩn
Mục đích xem xét khả năng phân biệt mẫu dương tính thật và mẫu âm tính thật của quy trình phân tích IHHNV với mồi 196F/R. Thí nghiệm được tiến hành với 10 lần phân tích trên mẫu âm tính IHHNV (mẫu tôm sạch bệnh) và 10 lần phân tích trên mẫu chuẩn dương tính IHHNV do đại học Arizona cung cấp. Kết quả không phát hiện 10/10 lần phân tích trên mẫu chuẩn âm. Ngược lại 10 lần thử trên mẫu chuẩn dương đều cho kết quả dương tính với IHHNV (Hình 3.23). Như vậy quy trình phân tích với mồi 196F/R hoàn toàn phân biệt mẫu âm tính IHHNV và mẫu dương tính IHHNV.
Chương 3. Kết quả - Bàn luận Phạm Văn Hùng
- 97 -
Nghiên cứu virus IHHNV (Infectious Hypodermal and Haematopoietic Necrosis Virus) trên tôm sú
Hình 3.23. Kết quả điện di sản phẩm PCR thí nghiệm trên vật liệu chuẩn.
M: thang DNA 100 – 1000 bp; (-): mẫu kiểm chứng âm IHHNV; (+): mẫu kiểm chứng dương IHHNV; (a): 1 –10: mẫu sạch bệnh không nhiễm IHHNV từ đại học Arizona. (b) 1 –10: mẫu chuẩn nhiễm IHHNV từ đại học Arizona.
3.4.3.4. So sánh với phương pháp PCR khác
Mục đích so sánh quy trình phát hiện IHHNV bằng kỹ thuật PCR có sử dụng mồi 196F/R với quy trình phân tích có sử dụng các cặp mồi 389F/R, 392F/R và 309F/R đã được công bố trong sổ tay phương pháp phân tích của OIE. Phương pháp được tiến hành theo quy trình phân tích PCR với các cặp mồi 389F/R và 392F/R của OIE và quy trình phân tích IHHNV vừa được xây dựng với mồi 196F/R. Thí nghiệm được tiến hành trên 10 mẫu tôm sú chỉ có trình tự DQ228358, không nhiễm IHHNV. Kết quả thu nhận như sau:
Đối với quy trình phân tích IHHNV bằng kỹ thuật PCR với mồi 389F/R và mồi 392F/R đều cho kết quả dương tính với IHHNV mặc dù mẫu được phân tích là mẫu tôm sú không nhiễm IHHNV mà chỉ có trình tự DQ228358 (Hình 3.24.A và B). Ngược lại quy trình phân tích IHHNV với mồi 196F/R không phát hiện IHHNV trên 10 mẫu tôm có trình tự DQ228358 (Hình 3.24.C). Kết quả thu được đã phản ảnh các cặp mồi 389F/R và 392F/R có khả năng cho kết quả dương tính
Chương 3. Kết quả - Bàn luận Phạm Văn Hùng
- 98 -
với IHHNV khi mẫu tôm sú có trình tự DQ228358. Điều này đã cho thấy các cặp mồi 389F/R và 392F/R không có khả năng phân biệt trình tự DQ228358 với IHHNV.
Hình 3.24. Kết quả điện di sản phẩm PCR của thí nghiệm phân tích so sánh giữa mồi 389F/R, 392F/R và 196F/R trên mẫu tôm sú có trình tự DQ228358.
M: thang DNA 100 – 1000 bp; (-): chứng âm IHHNV; (+): mẫu kiểm chứng dương IHHNV; 1 – 10: mẫu tôm sú có trình tự DQ228358; A: mồi 389F/R, B:
mồi 392F/R và C: mồi 196F/R.
Năm 2007, nhóm tác giả Tang và cộng sự đã công bố công trình nghiên cứu về quy trình phát hiện IHHNV với cặp mồi 309F/R [55]. Các tác giả đã tập trung vào nghiên cứu tính chuyên biệt của mồi trên cơ sở đánh giá khả năng phân biệt giữa IHHNV và trình tự DQ228358. Kết quả cho thấy mồi 309F/R có khả năng phân biệt tốt IHHNV và trình tự DQ228358. Điều này đã chứng minh rằng mồi 309F/R hoàn toàn đặc hiệu để phát hiện IHHNV.
Một số đặc điểm giống nhau giữa mồi 196F/R và 309F/R được phát hiện
Chương 3. Kết quả - Bàn luận Phạm Văn Hùng
- 99 -
Nghiên cứu virus IHHNV (Infectious Hypodermal and Haematopoietic Necrosis Virus) trên tôm sú
như sau: vùng trình tự hai cặp mồi bắt cặp khuếch đại là vùng giữa của bộ gen IHHNV. Cả hai cặp mồi đều khuếch đại một trong năm trình tự bảo tồn của bộ gen IHHNV. Không khuếch đại chéo trình tự DQ228358 và vì vậy các mồi này có tính chuyên biệt cao (vì mức độ tương đồng tối đa giữa DQ228358 so với IHHNV là 86 %). Đặc điểm khác biệt quan trọng giữa mồi 196F/R và 309F/R là mặc dù hai cặp mồi đều khuếch đại vùng trình tự giữa của bộ gen IHHNV nhưng cặp mồi 196F/R khuếch đại trình tự bảo tồn mã hóa cho protein khởi đầu sao chép II, còn cặp mồi 309F/R khuếch đại trình tự bảo tồn mã hóa cho NTP binding helicase A.
Một số đặc điểm khác biệt nữa của cặp mồi 196F/R so với cặp mồi 309F/R gồm nhiệt độ bắt cặp tối thích cao hơn, chiều dài của mồi ngắn hơn và kích thước sản phẩm PCR nhỏ hơn (Bảng 3.7).
Bảng 3.7. Một số đặc điểm của các mồi được sử dụng để phát hiện IHHNV Tên mồi
Đặc điểm
196F/R 309F/R 389F/R 392F/R Vùng trình tự mồi khuếch đại trên bộ gen Ở giữa Ở giữa Bên trái Bên trái Khuếch đại trình tự bảo tồn Có Có Không Không Khuếch đại chéo với trình tự DQ228358 Không Không Có Có Tính chuyên biệt của mồi Cao Cao Thấp Thấp Nhiệt độ bắt cặp tối thích (0C) 58 55 55 55 Kích thước mồi (bp) 20 22 20 20
Kích thước sản phẩm PCR (bp) 196 309 389 392 Bảng 3.6 cũng tóm tắt một số đặc điểm khác nhau của các cặp mồi 389F/R và 392F/R so với mồi 196F/R là cả hai cặp mồi này đều được thiết kế để khuếch đại vùng bên trái bộ gen và vì vậy không có khả năng khuếch đại một trong năm trình tự bảo tồn của bộ gen IHHNV. Cả hai mồi đều khuếch đại chéo với trình tự DQ228358 (Hình 3.24) nên tính chuyên biệt thấp hơn so với cặp mồi 196F/R.
Chương 3. Kết quả - Bàn luận Phạm Văn Hùng
- 100 -
3.4.3.5. Thử nghiệm PCR với mồi phát hiện gen nội chuẩn
Phương pháp PCR được đánh giá là phương pháp tiện lợi dùng để phát hiện nhanh virus. Tuy nhiên đôi khi phương pháp này có khả năng cho kết quả âm tính giả do sai sót trong quá trình phân tích. Để khắc phục điều này, mồi đặc hiệu dùng để phát hiện gen nội chuẩn (DNA của giáp sát mười chân) được sử dụng trong quy trình phân tích IHHNV. Kết quả thực nghiệm thu nhận được như sau:
Hình 3.25 là kết quả thí nghiệm phát hiện IHHNV bằng kỹ thuật PCR có thêm cặp mồi deca20a2/deca20s9 dùng để phát hiện gen nội chuẩn. Ở vị trí (-): là mẫu kiểm chứng âm IHHNV, không có DNA của IHHNV nên chỉ xuất hiện vạch 240 bp, là sản phẩm của cặp mồi deca20a2/deca20s9 khuếch đại DNA của tôm. Ở các vị trí (+): mẫu kiểm chứng dương IHHNV, 1 – 3 là mẫu nhiễm IHHNV, kết quả phân tích đều xuất hiện vạch 196 bp là DNA đích của IHHNV và vạch 240 bp là DNA của tôm. Như vậy mồi 196F/R đã cho kết quả khá rõ nét khi ứng dụng với mồi dùng làm nội chuẩn. Khi sử dụng dụng mồi nội chuẩn, mẫu được cho là dương tính với IHHNV khi trên bảng điện di xuất hiện đồng thời cả hai vạch DNA có kích thước 196 bp và 240 bp. Việc ứng dụng với mồi nội chuẩn sẽ giúp kiểm soát sai sót trong quá trình phân tích PCR và giảm thiểu khả năng cho kết quả âm tính giả.
Cặp mồi deca20a2/deca20s9 cũng thường được sử dụng làm mồi nội chuẩn trong các nghiên cứu khác. Cụ thể năm 2011, Trần Thị Tuyết Hoa và cộng sự đã Hình 3.25. Kết quả điện di sản
phẩm PCR của thí nghiệm có thêm nội chuẩn.
M: thang DNA 100 – 1000 bp; (-):
mẫu kiểm chứng âm IHHNV; (+):
mẫu kiểm chứng dương IHHNV; 1 – 3: mẫu nhiễm IHHNV.
Chương 3. Kết quả - Bàn luận Phạm Văn Hùng
- 101 -
Nghiên cứu virus IHHNV (Infectious Hypodermal and Haematopoietic Necrosis Virus) trên tôm sú
công bố kết quả nghiên cứu quy trình nested – PCR phát hiện WSSV và nội chuẩn giáp xác mười chân trên nhiều đối tượng cảm nhiễm. Tác giả đã sử dụng cặp mồi deca20a2/deca20s9 cùng với mồi phát hiện WSSV cho kết quả rất rõ nét [10].