1.4. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HIỆU QUẢ CHỐNG KẾT TẬP TIỂU CẦU CỦA CLOPIDOGREL
1.4.1. Ảnh hưởng của đa hình gen CYP2C19 đến hiệu quả chống kết tập tiểu cầu của clopidogrel
Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chống kết tập tiểu cầu của clopidogrel như: đa hình gen CYP2C19, tương tác thuốc, tình trạng hút thuốc, BMI, tuổi, đái tháo đường, ....
1.4.1. Ảnh hưởng của đa hình gen CYP2C19 đến hiệu quả chống kết tập tiểu cầu của clopidogrel
1.4.1.1. Đa hình gen CYP2C19
Cytochrom P450 có vai trò chuyển hóa thuốc bình thường khi các gen mã hóa enzym này ở dạng bình thường (*1/*1). Các gen mã hóa nhóm enzym Cytochrom P450 đều có hiện tượng đa hình. Đa hình gen Cyt. P450 quan trọng nhất đã được phát hiện gồm 1A2, 2C9, 2C19 và 2D6. Đa hình gen Cyt. P450 có liên quan có ý nghĩa lâm sàng về dược động học cũng như độc tính của nhiều thuốc [120].
19
Gen CYP2C19 nằm trên nhiễm sắc thể số 10 gồm 9 exon và 8 intron.
CYP2C19 có tính đa hình cao với 35 alen đã được phát hiện [122]. Vị trí của một số alen thường gặp trên gen CYP2C19 được thể hiện ở Bảng 1.1.
Bảng 1.1. Một số alen thường gặp trên gen CYP2C19
Alen Nucleotid biến đổi chính Số dbSNP Vị trí Hoạt tính enzym
*1 - - - Bình thường
*2 c.681G > A rs4244285 Exon 5 Không
*3 c.636G > A rs4986893 Exon 4 Không
*17 c. −806C > T rs12248560 Promoter Tăng
Chú thích: dbSNP: cơ sở dữ liệu về đa hình nucleotid đơn. Nguồn:
Pharmvar [122]
Bảng 1.2. Tần suất alen và phân bố kiểu hình gen CYP2C19 trên thế giới Khu vực Tần suất alen CYP2C19 (%) Tỉ lệ kiểu hình (%)
*1 *2 *3 EM IM PM
Châu Âu 85,3 14,6 0,1 73,1 24,2 2,7
Bắc Mỹ 83,7 16,3 0,0 68,4 28,0 3,6
Nam Mỹ 87,5 12,5 0,0 85,0 13,9 1,0
Châu Phi 84,3 15,1 0,6 72,0 25,2 2,9
Ấn Độ 63,6 35,5 0,9 37,7 47,3 15,0
Tây Á 86,2 13,3 0,4 74,8 23,5 1,8
Đông Á 65,2 29,1 5,7 44,7 45,4 10,0
Chú thích: EM: chuyển hóa mạnh; IM: chuyển hóa trung bình; PM:
chuyển hóa kém. Nguồn: Sipeky C. (2013) [142]
Tần suất alen CYP2C19 *2 ở người Đông Á (da vàng) khoảng 29%, cao hơn 2 lần ở người Châu Âu (da trắng) [142]. Tần suất alen CYP2C19 *3 ở người Đông Á khoảng 5%, trong khi ở người Châu Âu < 1%. Các alen CYP2C19 còn
20
lại mã hóa enzym không chức năng, tỉ lệ < 1%, không đáng kể [142]. Vì vậy, khi nghiên cứu về đa hình gen CYP2C19 ở người Đông Á, cần tập trung vào 2 alen CYP2C19 *2 và *3.
Tỉ lệ alen CYP2C19 khác nhau dẫn tới phân bố kiểu hình CYP2C19 cũng khác nhau giữa các chủng tộc, khu vực địa lý (Bảng 1.2). Tỉ lệ người có kiểu hình chuyển hóa trung bình và kém ở Đông Á chiếm tỉ lệ khoảng 55%, tương tự như ở Ấn Độ, cao hơn hẳn những khu vực Châu Âu, Bắc Mỹ, Châu Phi, Tây Á (khoảng 25 - 30%) [142]. Điều này chỉ ra rằng có sự khác biệt rất lớn về chuyển hóa các thuốc qua enzym CYP2C19 của người vùng Đông Á và Ấn Độ so với các khu vực còn lại trên thế giới.
Ở Việt Nam, cũng đã có một số nghiên cứu về kiểu hình CYP2C19, trong đó có 3 nghiên cứu trên người tình nguyện khỏe mạnh và 2 nghiên cứu trên bệnh nhân tim mạch. Tóm tắt kết quả nghiên cứu được trình bày trong Bảng 1.3.
Bảng 1.3. Kiểu hình CYP2C19 ở người Việt Nam
Tác giả Đối
tượng
Cỡ mẫu (N)
Kiểu hình CYP2C19 (%)
EM IM PM
Yamada S. (2001) [162] NTN 90 40 40 20
Lee S.S. (2007) [90] NTN 165 44,9 47,9 7,2
Veiga M. I. (2009) [157] NTN 74 35 53 12
Vũ Thị Thơm (2018) [14]
BN 54 44,4 40,7 14,8
Chú thích: BN: bệnh nhân; NTN: người tình nguyện; EM: chuyển hóa mạnh; IM: chuyển hóa trung bình; PM: chuyển hóa kém
Tổng hợp các nghiên cứu trình bày ở Bảng 1.3 cho thấy: tỉ lệ người Việt Nam có kiểu hình CYP2C19 chuyển hóa mạnh từ 35 - 50%. Còn lại (50 - 65%)
21
là kiểu hỡnh chuyển húa trung bỡnh và kộm. Như vậy, hơn ẵ dõn số mang alen CYP2C19 không chức năng. Điều này ảnh hưởng nhiều đến hiệu quả và an toàn của các thuốc chuyển hóa qua enzym CYP2C19.
1.4.1.2. Ảnh hưởng của đa hình gen CYP2C19 đến kháng clopidogrel
Xét nghiệm chức năng tiểu cầu giúp đánh giá mức độ đáp ứng clopidogrel, cũng như chỉ số kháng clopidogrel. Đa hình gen CYP2C19 làm thay đổi tỉ lệ kháng clopidogrel trong nhiều nghiên cứu [76, 81, 95]. Tổng hợp một số nghiên cứu về ảnh hưởng của đa hình gen tới kháng clopidogrel được trình bày ở Bảng 1.4.
Bảng 1.4. Liên quan alen CYP2C19 không chức năng và kháng clopidogrel Tác giả Cỡ mẫu
(N) 2C19 Kháng clopidogrel ở người mang alen không chức năng
Jeong Y. H.
(2010) [76]
126 PCI
*2, *3 ↑ kháng CLO ở nhóm IM/PM (OR = 5,5; 95%
CI: 1,3 - 23,3; p < 0,001) Hwang S. J.
(2011) [72]
190 PCI
*2, *3 ↑ kháng CLO ở nhóm IM/PM (OR = 3,4; 95%
CI: 1,7 - 6,7; p < 0,001) Liu, X.
(2016) [95]
222 ACS
*2,*3 ↑ kháng CLO ở nhóm PM (OR = 5,37; 95%
CI: 1,90 – 15,16; p = 0,01) Joo, H. J.
(2018) [81]
4.587 PCI
*2,*3 ↑ kháng CLO ở nhóm IM (OR = 2,08; 95%
CI: 1,75 – 2,47; p < 0,01) và nhóm PM (OR = 4,14; 95% CI: 3,34 – 5,14; p < 0,01)
Chú thích: ACS: hội chứng mạch vành cấp; CI: khoảng tin cậy; CLO:
clopidogrel; OR: tỷ suất chênh; PCI: can thiệp động mạch vành qua da;
Năm 2018, Hiệp hội dược lý di truyền clopidogrel quốc tế (ICPC - International Clopidogrel Pharmacogenomics Consortium) đã triển khai nghiên cứu ở 13 quốc gia trên 8.829 bệnh nhân cho thấy: có sự liên quan mạnh giữa
22
CYP2C19*2 và phản ứng tiểu cầu (p = 5,1 × 10-40) [25]. Như vậy, các nghiên cứu đều chỉ ra sự liên quan giữa đa hình gen CYP2C19 và kháng clopidogrel.
1.4.1.3. Ảnh hưởng của đa hình gen CYP2C19 tới một số biến cố tim mạch Nhiều nghiên cứu chỉ ra đa hình gen CYP2C19 có liên quan tới biến cố tim mạch nặng (MACE), trong đó, có vai trò của alen CYP2C19*2, *3. Tóm tắt kết quả một số nghiên cứu này được trình bày ở Bảng 1.5.
Bảng 1.5. Ảnh hưởng của alen CYP2C19 không chức năng tới biến cố tim mạch
Chú thích: ACS: hội chứng mạch vành cấp; MACE: biến cố tim mạch nặng; MI: nhồi máu cơ tim; PCI: can thiệp động mạch vành qua da; ST: huyết khối làm tắc stent
Trong nghiên cứu của Xi, Z. (2017): tác giả đã phân tích gộp 20 thử nghiệm lâm sàng với 15.056 bệnh nhân can thiệp ĐMV qua da và đưa ra kết
Tác giả 2C19 Cỡ mẫu
(N)
Đối tượng
Thời
gian Hậu quả
Hulot J. S. (2011) [71] *2 371 MI 6 năm ↑MACE
Mega J. L. (2009)
(TRITON TIMI - 38) [102]
*2 1.477 PCI+
ACS
15 tháng ↑MACE
Oh I.Y. (2012) [109] *2 2.146 PCI 1 năm ↑ST
Sibbing D. (2009) [141] *2 2.485 PCI 1 tháng ↑ST
Jeong Y. H. (2011) [77] *2, *3 266 MI 1 năm ↑MACE
Park, M. W. (2016), [115]
*2, *3 2.188 PCI 12 tháng ↑MACE
Zhang, M. (2016) [166] *2 600 MI 5 năm ↑tử vong
Siasos, G. (2017) [137] *2 408 PCI 13 tháng ↑MACE
Joo, H. J. (2018) [80] *2, *3 4,587 PCI + ACS
12 tháng ↑tử vong
23
luận: bệnh nhân chỉ cần mang 1 alen CYP2C19 không chức năng làm tăng rõ ràng biến cố tim mạch nặng [159]. Như vậy, tới thời điểm hiện nay, nhiều nghiên cứu cho rằng đa hình gen CYP2C19 có ảnh hưởng đến hiệu quả chống kết tập tiểu cầu của clopidogrel trên chỉ số trung gian (kháng clopidogrel) cũng như trên lâm sàng.
1.4.1.4. Khuyến cáo sử dụng clopidogrel theo đa hình gen CYP2C19
Hiệp hội dược lý di truyền lâm sàng ở Mỹ (CPIC) lần đầu đưa ra khuyến cáo về liên quan CYP2C19 và clopidogrel vào năm 2011, sau đó cập nhật năm 2013 [134]. Sơ đồ khuyến cáo cập nhật của CPIC thể hiện ở Hình 1.5.
Chú thích: ACS: hội chứng mạch vành cấp; PCI: can thiệp ĐMV qua da;
EM: chuyển hóa mạnh; IM: chuyển hóa trung bình; PM: chuyển hóa kém; UM:
chuyển hóa siêu mạnh; KTTC: kết tập tiểu cầu. Nguồn: Scott S. A. (2013) [134]
Nội dung khuyến cáo CPIC 2013 gồm:
- Xét nghiệm 2 alen CYP2C19 không chức năng *2 và *3.
- Với bệnh nhân mang kiểu hình chuyển hóa trung bình (IM), cân nhắc việc tăng liều clopidogrel (vì tăng liều làm tăng ức chế kết tập tiểu cầu)
Xem xét sử dụng clopidogrel trong điều trị ACS/PCI
Kết quả xét nghiệm CYP2C19
UM
(*1/*17, *17/*17)
EM
(*1/*1)
IM
(*1/*2, *1/*3, *2/*17)
PM
(*2/*2, *2/*3, *3/*3)
Liều chuẩn clopidogrel
Cân nhắc tăng liều hoặc thay thuốc
chống KTTC
Thay thế (prasugrel, ticagrelor,…)
Hình 1.5. Sơ đồ hướng dẫn sử dụng thuốc chống kết tập tiểu cầu của CPIC
24
hoặc thay thế thuốc chống kết tập tiểu cầu khác (prasugrel, ticagrelor,...).
- Với bệnh nhân mang kiểu hình chuyển hóa kém (PM) nên thay thế thuốc chống kết tập tiểu cầu khác (prasugrel, ticagrelor,...) vì tăng liều clopidogrel ở bệnh nhân này không hiệu quả.
- Cân nhắc một số yếu tố liên quan đến hiệu quả chống kết tập tiểu cầu của clopidogrel (đái tháo đường, tuổi, BMI, PPI, ...).
FDA Mỹ cũng có cảnh báo đóng khung “Giảm hiệu quả chống kết tập tiểu cầu ở bệnh nhân mang 2 alen không chức năng của gen CYP2C19” trên tờ hướng dẫn sử dụng và thông tin kê đơn thuốc clopidogrel cập nhật 5/2019 [154], với nội dung:
- Hiệu quả của viên nén clopidogrel phụ thuộc vào chất chuyển hóa có hoạt tính của clopidogrel thông qua Cyt. P450 với vai trò chủ yếu của CYP2C19.
- Xét nghiệm gen CYP2C19 có giá trị để xác định bệnh nhân PM.
- Cân nhắc chuyển thuốc chống kết tập tiểu cầu khác nhóm ức chế P2Y12.
Thực tế, đã có một số nghiên cứu áp dụng khuyến cáo này trong sử dụng clopidogrel. Nghiên cứu của Zhong Z. (2018) đăng trên European Journal of Clinical Pharmacology, đã tiến hành nghiên cứu trên 934 bệnh nhân HCMVC người Trung Quốc. Bệnh nhân được làm xét nghiệm gen CYP2C19*2 và *3. Tất cả bệnh nhân đều được dùng clopidogrel liều nạp 300 - 600 mg và aspirin liều nạp 300 mg trước khi can thiệp ĐMV qua da. Sau đó, chia nhóm bệnh nhân để dùng thuốc chống kết tập tiểu cầu như sau: nhóm 1 gồm 377 bệnh nhân EM:
clopidogrel 75 mg/ngày; nhóm 2 gồm 426 bệnh nhân IM: clopidogrel 150 mg/ngày; nhóm 3 gồm 131 bệnh nhân PM: ticagrelor 90 mg x 2 lần/ngày; cả 3
25
nhóm đều dùng aspirin 100 mg/ngày. Sau 12 tháng, MACE và biến cố chảy máu nặng ở cả 3 nhóm không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê [167].
Notarangelo F. M. (2018) đăng trên JACC, nghiên cứu trên 888 bệnh nhân HCMVC ở Italia, chia bệnh nhân làm 2 nhóm, nhóm 1 được làm gen và điều chỉnh thuốc theo gen, nhóm 2 được điều trị thường quy (theo khuyến cáo ưu tiên ticagrelor, prasugrel). Kết quả cho thấy nhóm bệnh nhân được điều chỉnh thuốc theo gen cá thể giảm được biến chứng chảy máu và biến cố tim mạch nặng sau 12 tháng so với nhóm bệnh nhân được điều trị thường quy [108].
Cavallari L.H. (2018) đăng trên JACC Cardiovasc Interv, nghiên cứu đa trung tâm ở Mỹ với mục tiêu đánh giá việc thay thế thuốc chống kết tập tiểu cầu dựa vào kết quả xét nghiệm gen trên bệnh nhân can thiệp ĐMV qua da có ảnh hưởng tới MACE sau 12 tháng. Nghiên cứu trên 1.815 bệnh nhân can thiệp ĐMV qua da trong đó có 575 bệnh nhân IM/PM, 1.210 bệnh nhân HCMVC. Kết quả cho thấy nhóm bệnh nhân IM/PM được dùng clopidogrel và nhóm bệnh nhân IM/PM được dùng thuốc chống kết tập tiểu cầu khác (prasugrel hoặc ticagrelor) có MACE 23,4% và 8,7% (khác biệt có ý nghĩa thống kê); Nhóm bệnh nhân EM được dùng clopidogrel và nhóm bệnh nhân IM/PM được dùng thuốc chống kết tập tiểu cầu thay thế có MACE như nhau [35].
Lee, C. R (2018) đăng trên tạp chí Circulation, Genomic and Precision Medicine, thực hiện nghiên cứu trên 1.193 bệnh nhân can thiệp ĐMV qua da ở Mỹ, nhóm 1: bệnh nhân EM dùng clopidogrel, nhóm 2: bệnh nhân IM/PM dùng ticagrelor hoặc prasugrel. Kết quả MACE và chảy máu sau 12 tháng ở 2 nhóm như nhau [89].
Jiang, M. (2017) thực hiện nghiên cứu phân tích Chi phí / Hiệu quả của việc điều trị thuốc chống kết tập tiểu cầu trên bệnh nhân HCMVC có can thiệp ĐMV qua da từ nhiều nghiên cứu lâm sàng trước đó, chia 3 nhóm bệnh nhân:
nhóm 1: dùng clopidogrel; nhóm 2: dùng prasugrel hoặc ticagrelor; nhóm 3:
26
điều chỉnh thuốc chống kết tập tiểu cầu dựa vào xét nghiệm CYP2C19 (EM dùng clopidogrel; IM/PM dùng ticagrelor/prasugrel). Kết quả cho thấy: sử dụng thuốc chống kết tập tiểu cầu nhóm ức chế P2Y12 dựa vào kết quả xét nghiệm đa hình gen CYP2C19 có chỉ số Chi phí / Hiệu quả tốt nhất [78].
Kim, K. (2019) tiến hành nghiên cứu phân tích Chi phí / Hiệu quả của các chiến lược điều trị thuốc chống kết tập tiểu cầu trên bệnh nhân HCMVC không hoặc có kết hợp với xét nghiệm đa hình gen CYP2C19. Kết quả cho thấy: điều trị clopidogrel + xét nghiệm CYP2C19 có chi phí thấp nhất [83].
Những nghiên cứu được tổng hợp ở trên mở ra triển vọng cá thể hóa sử dụng thuốc chống kết tập tiểu cầu thay thế phác đồ chuẩn chung.
1.4.1.5. Các phương pháp xác định đa hình gen CYP2C19
Phương pháp xác định đa hình gen CYP2C19 từ DNA tách từ mẫu máu toàn phần trong EDTA. Mẫu máu toàn phần để ở nhiệt độ phòng, chất lượng và số lượng DNA gần như không thay đổi trong 48 giờ, sau 7 ngày thì nồng độ DNA có giảm nhưng vẫn phân tích được [31]. Khi được bảo quản ở 4oC, mẫu máu toàn phần này có thể để được 2 năm và nồng độ DNA giảm khoảng 50%
nhưng vẫn định lượng được DNA [126]. Khi bảo quản mẫu máu toàn phần ở - 20oC đến - 30oC, sau 19 - 30 năm, DNA được tách từ mẫu máu này vẫn đảm bảo chất lượng và số lượng [42, 47].
Mẫu DNA sau khi được tách từ mẫu máu toàn phần được dùng cho xác định CYP2C19*2, *3 theo một trong số các phương pháp đang được áp dụng rộng rãi sau: giải trình tự gen (DNA sequencing), Real-time PCR, RFLP - PCR và ARMS - PCR.
Phương pháp giải trình tự gen của Sanger dựa trên nguyên lý hoạt động của enzyme DNA polymerase và Dideoxynucleotide triphosphate (ddNTP) tham gia vào quá trình tổng hợp DNA. Khi DNA polymerase xúc tác kéo dài mạch DNA mới gặp nucleotid không có nhóm 3’OH (dideoxynucleotid), phản ứng
27
tổng hợp dừng lại và tạo ra các đoạn DNA chênh lệch nhau 1 nucleotid. Điện di các đoạn DNA giúp xác định được trình tự DNA [66, 132]. Phương pháp này có độ chính xác cao nhất, được coi là tiêu chuẩn vàng trong phân tích gen và được dùng làm tiêu chuẩn để thẩm định các phương pháp xét nghiệm gen khác. Tuy nhiên, phương pháp này có nhược điểm là kỹ thuật phức tạp, tốn thời gian, thiết bị đắt tiền [49]. Một số nghiên cứu đã sử dụng phương pháp này trong xác định đa hình gen CYP2C19: Lee S.S. (2007) [90], Zhong Z. (2018) [167], Sibbing D.
(2009) [141].
Phương pháp Real-time PCR khuếch đại DNA đích được hiển thị ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng, vì vậy, được gọi là Real-time. Phương pháp này không cần điện di, độ lặp lại tốt, cho kết quả nhanh nhưng nhược điểm là mồi cần phải gắn huỳnh quang và giá thành cao [36, 49]. Vì cho kết quả nhanh nên nhiều nghiên cứu về đa hình gen CYP2C19 quy mô lớn đã áp dụng phương pháp này như: Jeong Y. H. (2010) [76], Oh I.Y. (2012) [109], Wallentin L.
(2010) [158], Notarangelo F. M. (2018) [108].
Phương pháp RFLP - PCR (Polymerase chain reaction with restriction fragment length polymorphism - kỹ thuật đa hình độ dài đoạn cắt giới hạn) nghiên cứu tính đa hình chiều dài của các phân đoạn DNA dựa trên điểm cắt của các enzyme giới hạn. Phương pháp RFLP - PCR có nhiều công đoạn phải thao tác bằng tay tốn thời gian hơn phương pháp ARMS - PCR, tuy nhiên, phương pháp này có ưu điểm là hóa chất đơn giản, ít thời gian hơn DNA sequencing [68]. Một số nghiên cứu đã sử dụng phương pháp này trong xác định đa hình gen CYP2C19: Vũ Thị Thơm (2018) [14], Yamada S. (2001) [162], Veiga M. I.
(2009) [157], Hulot J. S. (2011) [71]
Phương pháp ARMS - PCR giúp xác định các đột biến điểm, trong đó sử dụng cặp mồi đặc hiệu, chỉ cho phép khuếch đại khi nó được bắt cặp với vị trí đặc hiệu. Đây cũng là phương pháp để xác định kiểu gen là đồng hợp tử hay dị hợp tử. Dị hợp tử và đồng hợp tử được xác định bằng cách sử dụng mồi riêng
28
biệt cho alen không chức năng và alen bình thường (*1). Các phản ứng được thực hiện trong các ống riêng biệt. Sản phẩm sau khi khuếch đại sẽ được điện di để quan sát, nếu sản phẩm đặc hiệu xuất hiện ở cả 2 ống là kiểu gen dị hợp tử, chỉ xuất hiện ở ống với cặp mồi bình thường là đồng hợp tử bình thường, và ngược lại chỉ xuất hiện ở ống với cặp mồi đột biến là đồng hợp tử đột biến.
Phương pháp ARMS - PCR có nhược điểm cần nhiều phản ứng, nhưng có ưu điểm nổi bật là giá thành thấp nhất, tốn ít thời gian, thiết bị hóa chất phổ biến [49]. Một số nghiên cứu về CYP2C19 đã áp dụng phương pháp này như:
Hersberger M. (2001) [68], Jin C. (2019) [79], Xuhong Y. (2019) [161], Chawla P. K. (2015) [41].