Chương 2. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.2. Quy trình nghiên cứu
Quá trình nghiên cứu được tóm tắt trong sơ đồ nghiên cứu Hình 2.1.
2.2.2.1. Thu thập thông tin bệnh nhân trong thời gian nằm viện
Thông tin chung bệnh nhân: thông tin liên hệ, tuổi, giới tính, chiều cao, cân nặng, chẩn đoán, bệnh mắc kèm, tiền sử, thói quen hút thuốc lá, phương pháp điều trị.
Xét nghiệm sinh hóa máu: glucose, HbA1c, ure, creatinin, cholesterol, HDL - C, LDL - C, triglycerid, AST, ALT, CK - MB, troponin. Công thức máu:
số lượng hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu. Sử dụng thuốc: thuốc chống kết tập tiểu cầu, chống đông, statin, ƯCMC, CTTA, chẹn beta, chẹn kênh calci, nitrate, PPI.
Biến cố tim mạch (nếu có): tử vong do tim mạch, NMCT tái phát, đột quỵ não, xuất huyết.
2.2.2.2. Thu thập mẫu máu
Trong nghiên cứu này, bệnh nhân được thu thập mẫu máu làm xét nghiệm gen và xét nghiệm đo độ kết tập tiểu cầu.
Trong thời gian 3 – 7 ngày sau khi bệnh nhân dùng clopidogrel liều duy trì hàng ngày, hiệu quả ức chế kết tập tiểu cầu của clopidogrel đạt trạng thái ổn định [131], nên trong nghiên cứu này, mẫu máu được lấy ở thời điểm sau 5 ngày dùng liều duy trì clopidogrel. Lấy máu tĩnh mạch lúc đói chưa ăn sáng bằng dụng cụ kim luồn BD 23G vào tuýp chân không BD (Mỹ) [62].
38
Mục tiêu 1 Mục tiêu 2
Bệnh nhân mạch vành cấp vào khoa Tim mạch Bệnh viện Quân y 103
Thu thập thông tin bệnh nhân:
- Thông tin chung - Xét nghiệm sinh hóa - Xét nghiệm huyết học - Sử dụng thuốc
- Biến cố tim mạch
Xét nghiệm đo độ kết tập tiểu cầu LTA-ADP5 (MPA)
Sau 5 ngày dùng clopidogrel
Thu thập thông tin bệnh nhân 30 ngày sau xuất viện: Biến cố tim mạch
Xác định yếu tố ảnh hưởng đến kháng clopidogrel
Sau 30 ngày xuất viện
Xét nghiệm gen CYP2C19*2 và *3 Trong vòng
60 ngày Trong thời gian
nằm viện
Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu
39
2 ml máu đầu tiên được lấy vào tuýp chân không BD chứa chất chống đông K2 EDTA 3,6 mg dạng phun sương dùng cho xét nghiệm gen. Khi đưa kim luồn vào tĩnh mạch sẽ gây tổn thương mạch máu, và kích hoạt phản ứng tiểu cầu. Do vậy, 2 ml đầu tiên dùng cho xét nghiệm gen, không dùng được cho xét nghiệm kết tập tiểu cầu. 4 ml máu tiếp theo được lấy vào 2 tuýp chân không BD tráng silicon chứa 0,2 ml natri citrat 3,2% dùng cho xét nghiệm kết tập tiểu cầu. Lắc nhẹ ống nghiệm để tránh vỡ hồng cầu. Sử dụng ống nghiệm chân không giúp lấy chính xác lượng máu cần thiết, trực tiếp từ kim luồn vào tuýp xét nghiệm, không phải chuyển qua dụng cụ bơm tiêm, nên tránh được khả năng làm vỡ tiểu cầu. Dùng ống nghiệm tráng silicon giúp giảm va đập của tiều cầu, tránh tình trạng bị vỡ tiểu cầu, gây kích hoạt phản ứng tiểu cầu [77, 147].
Quá trình vận chuyển máu nhẹ nhàng, tránh để vỡ hồng cầu, tiểu cầu.
Mẫu máu cho xét nghiệm kết tập tiểu cầu (ống nghiệm citrat 3,2%) được bảo quản ở nhiệt độ phòng và được xử lý trong vòng 2 giờ, theo nghiên cứu của Stegnar M., sau 2 giờ, sẽ cho kết quả đo độ kết tập tiểu cầu bằng phương pháp LTA không chính xác [147]. Mẫu máu cho xét nghiệm gen CYP2C19 (ống nghiệm EDTA) được đánh mã và bảo quản trong tủ lạnh - 200C, theo nghiên cứu trước, mẫu máu toàn phần bảo quản ở nhiệt độ này có thể bảo quản tới 30 năm [42, 47], trong nghiên cứu này chúng tôi tập trung xử lý mẫu trong 60 ngày.
2.2.2.3. Đo độ kết tập tiểu cầu
Đo độ kết tập tiểu cầu (MPA) bằng phương pháp LTA, sử dụng ADP 5 àM làm chất kớch thớch kết tập tiểu cầu [28, 72, 76].
Nguyên lý của phương pháp LTA:
Thiết bị đo độ kết tập tiểu cầu bằng phương pháp quang học (đo ánh sáng truyền qua) là một quang phổ kế có bước sóng thích hợp cố định. Một chùm tia ánh sáng đơn sắc (bước sóng từ 935 - 955 nm) chiếu qua một ống chứa huyết tương giàu tiểu cầu và một chùm tia khác chiếu qua một ống chứa huyết tương
40
nghèo tiểu cầu. Khi đo, sử dụng một mẫu huyết tương giàu tiểu cầu của mẫu máu cần đo để thiết lập điểm chuẩn ở đó ánh sáng bị cản hoàn toàn và ánh sáng truyền qua là 0%. Đồng thời sử dụng huyết tương nghèo tiểu cầu của cùng mẫu máu để thiết lập điểm chuẩn ở đó ánh sáng đi qua hoàn toàn và độ dẫn truyền ánh sáng là 100%. Khi cho chất kích thích kết tập tiểu cầu (ADP, acid arachidonic) vào huyết tương giàu tiểu cầu sẽ xảy ra hiện tượng các tiểu cầu kết tập với nhau tạo thành đám, vì vậy, ánh sáng truyền qua đó tăng lên. Tỉ lệ % ánh sáng truyền qua phản ánh mức độ kết tập tiểu cầu (MPA). Kết quả được thể hiện bằng mức tối đa % ánh sáng truyền qua huyết tương giàu tiểu cầu sau khi sử dụng chất kích thích kết tập tiểu cầu.
Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng ADP là chất kích thích kết tập tiểu cầu do chất này đặc trưng cho cơ chế tác dụng chống kết tập tiểu cầu của clopidogrel.
Đơn vị đo độ kết tập tiểu cầu: %.
Đánh giá:
Giá trị độ kết tập tiểu cầu trên bệnh nhân sử dụng clopidogrel được dùng để đánh giá đáp ứng của bệnh nhân với clopidogrel, kháng clopidogrel được trình bày ở Mục 1.3.3 và Mục 2.4.5. Chúng tôi sử dụng phương pháp đánh giá độ kết tập tiểu cầu tại 1 thời điểm sau dùng thuốc clopidogrel.
MPA ≥ 50%: kháng clopidogrel.
MPA < 50%: không kháng clopidogrel.
Tiến hành:
Sử dụng 2 tuýp mẫu máu của cùng bệnh nhân dùng cho xét nghiệm kết tập tiểu cầu. Tiến hành ly tâm để tách lấy huyết tương giàu tiểu cầu và huyết tương nghèo tiểu cầu.
Mẫu huyết tương giàu tiểu cầu: Mẫu máu được ly tâm ở tốc độ 120G trong 10 phỳt ở nhiệt độ phũng. Lấy 500 àL lớp huyết tương ở trờn cho vào cóng thủy tinh đã chứa bi từ (dùng để đo độ kết tập tiểu cầu).
41
Mẫu huyết tương nghèo tiểu cầu: Mẫu máu được ly tâm ở tốc độ 850G trong 10 phỳt ở nhiệt độ phũng. Lấy 500 àL lớp huyết tương ở trờn cho vào cóng thủy tinh không chứa bi từ.
Ủ 2 cóng thủy tinh chứa huyết tương ở nhiệt độ 37oC trong 5 phút.
Cho 2 cóng thủy tinh chứa huyết tương vào vị trí đo của máy và chạy cân bằng trong 2 phút.
Thờm ADP 5 àM vào mẫu huyết tương giàu tiểu cầu.
Thời gian đo: 5 - 10 phút, ghi nhận độ kết tập tiểu cầu (MPA).
Hình 2.2 thể hiện hình ảnh xét nghiệm đo độ kết tập tiểu cầu bằng phương pháp LTA với chất kích kết tập tiểu cầu là ADP.
Hình 2.2. Hình ảnh xét nghiệm đo độ kết tập tiểu cầu 2.2.2.4. Thu thập thông tin bệnh nhân 30 ngày sau xuất viện
Bệnh nhân được tái khám tại Khoa Tim mạch - Bệnh viện Quân y 103 sau 30 ngày ra viện, ghi nhận các biến cố (tử vong do tim mạch, NMCT tái phát, đột quỵ não, tái nhập viện vì lý do tim mạch, xuất huyết).
Toàn bộ thông tin được ghi vào “Phiếu thu thập thông tin bệnh nhân nghiên cứu” (Phụ lục 3).
42 2.2.2.5. Xét nghiệm gen CYP2C19*2, *3
Trong nghiên cứu này, ngoài việc xác định đa hình gen CYP2C19*2 và CYP2C19*3, chúng tôi còn phát triển phương pháp ARMS - PCR với kỹ thuật đơn giản, thời gian ngắn và giá thành phù hợp. Tuy nhiên, hiện nay phương pháp giải trình tự gen vẫn được coi là tiêu chuẩn vàng trong việc đánh giá độ chính xác của các kỹ thuật sinh học phân tử. Vì vậy, ban đầu, chúng tôi sử dụng cả 2 phương pháp ARMS - PCR [68] và giải trình tự gen để xác định đa hình gen CYP2C19*2 và CYP2C19*3 trên 46 mẫu DNA. Sau đó, tiến hành phương pháp ARMS - PCR trên 70 mẫu DNA để xác định đa hình gen CYP2C19*2 và CYP2C19*3.
Trong phần này, nghiên cứu sinh trình bày phương pháp và cách tiến hành để xác định kiểu gen CYP2C19 *2 và *3, phần phân loại kiểu hình gen CYP2C19 được trình bày ở Mục 2.4.3:
a) Tách DNA
Tách DNA từ tế bào bạch cầu trong máu toàn phần theo bộ Kit Qiagen mini DNA extraction.
Thêm 20 μl Proteinase K vào ống Eppendoft 1,5 ml đã chứa sẵn 200 μl máu. Thêm 200 μl Buffer AL, trộn đều bằng pipet và lắc vortex trong 15 giây. Ủ ở 56°C trong 10 phút. Thêm 200 μl cồn tuyệt đối, trộn đều bằng pipet. Chuyển hỗn hợp dung dịch sang cột lọc, ly tâm 8.000 vòng/phút x 1 phút. Thay ống chứa mới. Thêm 500 μl Buffer AW1, lưu ý không làm ướt vành ống. Ly tâm 8.000 vòng/phút x 1 phút. Loại bỏ dịch, thay ống thu mới. Thêm 500 μl Buffer AW2, ly tâm 13.000 vòng/phút x 3 phút. Loại bỏ dịch, thay ống thu mới, ly tâm 13.000 vòng/phút x 1 phút. Loại bỏ dịch, thay ống Eppendoft 1,5 ml để thu DNA. Thêm 200 μl AE, ủ tại chỗ 3 phút, ly tâm 13.000 vòng/phút x 1 phút.
Kiểm tra chất lượng dịch DNA chiết được bằng phương pháp đo độ hấp thụ ánh sáng UV. Để đảm bảo chất lượng DNA cho PCR, yêu cầu dịch chiết DNA có tỉ lệ A260/A280 từ 1,8 - 2,0 [56]. Mẫu DNA tinh sạch này được dùng để
43
xác định CYP2C19*2 và *3 theo phương pháp ARMS - PCR và giải trình tự gen.
b) Khuếch đại bằng PCR
Khuếch đại PCR cho phương pháp ARMS - PCR:
Trình tự mồi được thiết kế dựa vào phần mềm trực tuyến Primer Blast (NCBI) và được tổng hợp bởi công ty Integrated DNA Technologies IDT (Mỹ).
Mỗi cặp mồi được chạy thành 2 ống, nghĩa là mỗi mẫu sẽ được chạy 4 phản ứng riêng biệt. Thành phần phản ứng ARMS - PCR gồm: Mastermix 6,25 àl; Mồi xuụi chung 0,5 àl; Mồi ngược đặc hiệu 0,5 àl; FSEA 0,5 àl; RSEA 0,5 àl và DNA 4,25 àl; Tổng 12,5 àl.
Bảng 2.1. Trình tự mồi CYP2C19 cho phản ứng ARMS - PCR
Chú thích: ASP allele specific primer (mồi đặc hiệu cho alen); FP forward primer (mồi xuôi); RP reverse primer (mồi ngược); ** Chứng nội tại.
Phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen CYP2C19*2 và *3 theo chu trình nhiệt như sau: 1 chu kỳ ở 950C trong 5 phút; 40 chu kỳ (40 giây ở 940C; 40 giây ở 57,40C cho *2 hoặc 40 giây ở 540C cho *3; 40 giây ở 720C); 1 chu kỳ ở 720C trong 10 phút; lưu mẫu ở 4 - 80C
Khuếch đại PCR cho phương pháp giải trình tự gen:
Đa hình Trình tự mồi Kích thước
sản phẩm CYP2C19*2
(681G > A)
FP 5’ - CCCACTATCATTGATTATTTCTCG - 3’
203 bp ASP 5’ - CCCACTATCATTGATTATTTCTCA - 3’
RP 5’ - ACGCAAGCAGTCACATAACTA - 3’
CYP2C19*3 (636G > A)
FP 5’ - GGATTGTAAGCACCCCCAGG - 3’
159 bp ASP 5’ - GGATTGTAAGCACCCCCAGA - 3’
RP 5’ - TCACCCCATGGCTGTCTAGG - 3’
Gen SEA** F SEA 5’ - TTCGCAGGAACTCGGTCGTC - 3’
861 bp R SEA 5’ - AGGACCTTGGATGGCGTTGG - 3’
44
Trình tự mồi được thiết kế dựa vào phần mềm trực tuyến Primer Blast (NCBI) và được tổng hợp bởi công ty Integrated DNA Technologies IDT (Mỹ).
CYP2C19*2 - F: 5’ - AATTACAACCAGAGCTTGGC - 3’
CYP2C19*2 - R: 5’ - TATCACTTTCCATAAAAGCAAG - 3’
CYP2C19*3 - F: 5’ - AAATTGTTTCCAACATTTAGCT - 3’
CYP2C19*3 - R: 5’ - ACTTCAGGGCTTGGTCAATA - 3’
Phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen CYP2C19*2 và *3 theo chu trình nhiệt như sau: tiền biến tính ở 960C trong 2 phút, 1 chu kỳ; 35 chu kỳ (30 giây ở 950C, 1 phút ở 570C cho *2 hoặc 1 phút ở 560C cho *3, 1 phút ở 720C); 1 chu kỳ 10 phút ở 720C; lưu mẫu ở 4 - 80C.
c) Điện di và đọc kết quả
Phương pháp ARMS - PCR:
Mẫu chạy với cặp mồi CYP2C19*1 Mẫu chạy với cặp mồi CYP2C19*2
Hình 2.3. Hình ảnh điện di CYP2C19*2 (681G > A) trên gel agarose 2%
Chú thích: (-): đối chứng âm; (+): đối chứng dương - mẫu DNA của bệnh nhân mang kiểu gen dị hợp tử; M: thang chuẩn 100bp; 1 - 5: mẫu DNA bệnh nhân (1 - GG, 2 - GA, 3 - GG, 4 - AA, 5 - GG).
861 bp
(chứng nội tại)
203 bp (-) (+) 1 2 3 4 5 M (-) (+) 1 2 3 4 5
45
Mẫu chạy với cặp mồi CYP2C19*1 Mẫu chạy với cặp mồi CYP2C19*3
Hình 2.4. Hình ảnh điện di CYP2C19*3 (636G > A) trên gel agarose 2%
Chú thích: (-): đối chứng âm; (+): đối chứng dương - mẫu DNA của bệnh nhân mang kiểu gen dị hợp tử; M: thang chuẩn 100bp; 1 - 5: mẫu DNA bệnh nhân (1 - GG, 2 - GG, 3 - GA, 4 - GG, 5 - AA).
Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 2% với điều kiện 110V - 30 phút. Sản phẩm điện di được nhuộm với Ethidium Bromide và được phân tích kết quả hình ảnh dưới tia UV. Hình ảnh điện di CYP2C19*2 và *3 cần phải đạt được yêu cầu thể hiện trong Hình 2.3 và
Hình 2.4.
Phương pháp này đọc kết quả trực tiếp trên bản chạy điện di.
Phương pháp giải trình tự gen:
Sản phẩm PCR của phương pháp giải trình tự gen được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 2% pha trong đệm TAE 1X, nhuộm với Ethidium Bromide và soi dưới đèn UV, so sánh với thang chuẩn. Yêu cầu: mẫu thử chỉ có 1 băng điện di sáng duy nhất tương ứng với chứng dương (Hình 2.5).
861 bp
(chứng nội tại)
159 bp (-) (+) 1 2 3 4 5 M (-) (+) 1 2 3 4 5
46
Chú thích: F - /F+ là các đối chứng âm/dương; M là Marker, 01 - 06 là thứ tự các mẫu nghiên cứu.
Xác định vị trí đa hình gen bằng phương pháp PCR giải trình tự theo bộ BigDye Terminator V3.1 Cycle Sequencing Kit. Phân tích bằng phần mềm BioEdit version 7.2.6. Một số hình ảnh giải trình tự gen CYP2C19*2, *3 được thể hiện ở các hình dưới đây:
Hình 2.6. Hình ảnh giải trình tự CYP2C19*2 (*1/*1 - GG)
Hình 2.7. Hình ảnh giải trình tự CYP2C19*2 (*1/*2 - GA)
Hình 2.5. Kết quả điện di sản phẩm PCR của CYP2C19*2 và CYP2C19*3 Mẫu chạy với gen CYP2C19*2 Mẫu chạy với gen CYP2C19*3
47
Hình 2.8. Hình ảnh giải trình tự CYP2C19*2 (*2/*2 - AA)
Hình 2.9. Hình ảnh giải trình tự CYP2C19*3 (*1/*1 - GG)
Hình 2.10. Hình ảnh giải trình tự CYP2C19*3 (*1/*3 - GA)
Hình 2.11. Hình ảnh giải trình tự CYP2C19*3 (*3/*3 - AA) Kết quả làm xét nghiệm gen CYP2C19*2, *3 được liệt kê ở Phụ lục 5.
CYP2C19*2 (681 G > A): *2/*2 - AA; *1/*2 - GA; *1/*1 - GG CYP2C19*3 (636 G > A): *3/*3 - AA; *1/*3 - GA; *1/*1 - GG
48
2.2.2.6. Xác định yếu tố ảnh hưởng đến kháng clopidogrel a) Xây dựng mô hình hồi quy logistic đa biến:
Phân tích theo phương pháp BMA (Bayesian Model Averaging) được sử dụng để xây dựng mô hình hồi quy logistic các yếu tố ảnh hưởng tới kháng clopidogrel [53, 106]. Mô hình hồi quy logistic đa biến được lựa chọn là mô hình có xác suất hậu định cao nhất và BIC nhỏ nhất trong tất cả các mô hình khảo sát. Các yếu tố được đưa vào mô hình được trình bày ở Bảng 2.2 (trang sau).
Yếu tố được xác định ảnh hưởng tới kháng clopidogrel trong các nghiên cứu trước đó: tuổi [69], giới tính, BMI [69], bệnh mắc kèm (tăng huyết áp, đái tháo đường, rối loạn lipid máu, thiếu máu cục bộ) [69, 72], tình trạng hút thuốc lá [24], đa hình gen CYP2C19 [15], tương tác thuốc với PPI [19], liều nạp clopidogrel, liều duy trì clopidogrel [55].
Yếu tố được nhóm nghiên cứu dự đoán có thể ảnh hưởng tới kháng clopidogrel: liều nạp aspirin, liều duy trì aspirin, sử dụng các thuốc đồng quản lý HCMVC (ức chế men chuyển, chẹn beta, chẹn kênh calci).
b) Đánh giá mô hình hồi quy logistic đa biến:
Mô hình hồi quy logistic lựa chọn được đánh giá tính phân định và độ tin cậy của mô hình.
Tính phân định của mô hình:
Mô hình hồi quy logistic dựa trên các yếu tố được xây dựng phải phân định bệnh nhân trong nghiên cứu thành 2 nhóm: bệnh nhân kháng clopidogrel và bệnh nhân không kháng clopidogrel. Khả năng phân định của mô hình được đánh giá thông qua diện tích dưới đường cong (AUC) của đường biểu diễn ROC. Đường biểu diễn ROC gồm có trục tung là độ nhạy và trục hoành là xác suất dương tính giả (1 - độ đặc hiệu). Đường biểu diễn ROC là thông số dung hoà giữa độ nhạy và tỉ lệ dương tính giả của một mô hình tiên lượng.
49
Bảng 2.2. Phân hạng các yếu tố đưa vào mô hình BMA
Yếu tố Nhóm tham chiếu Nhóm so sánh
Tuổi Biến định lượng
Giới tính Nữ Nam
BMI BMI < 18,5 BMI: 18,5 - 23
BMI ≥ 23
Hút thuốc lá Không Có
Đái tháo đường Không Có
Tăng huyết áp Không Có
Rối loạn lipid máu Không Có
Tiền sử NMCT Không Có
Tiền sử BTTMCBMT Không Có
Đa hình gen CYP2C19 EM IM hoặc PM
Liều nạp clopidogrel Nạp 300 mg Nạp 600 mg Liều nạp aspirin Không nạp Nạp 162 - 325 mg Liều duy trì clopidogrel 75 mg 150 mg
Liều duy trì aspirin Không duy trì Có duy trì
ƯCMC Không Có
CTTA Không Có
Chẹn beta Không Có
Chẹn kênh calci Không Có
PPI Không Có
Chú thích: BMI: chỉ số khối cơ thể; BTTMCBMT: bệnh tim thiếu máu cục bộ mạn tính; CTTA: chẹn thụ thể angiotensin; EM: kiểu hình chuyển hóa nhanh;
PPI: ức chế bơm proton; ƯCMC: ức chế men chuyển.
50
Giá trị AUC của đường biểu diễn ROC dao động từ 0,5 đến 1. Giá trị AUC càng cao phản ảnh mô hình có khả năng phân định tốt 2 nhóm bệnh nhân.
Mô hình được được chấp nhận về tính phân định khi chỉ số AUC từ 0,70 đến 1,00 [64].
Độ tin cậy của mô hình:
Mô hình hồi quy logistic cần tiên lượng khả năng kháng clopidogrel của bệnh nhân thông qua các yếu tố trong mô hình. Độ tin cậy của mô hình hồi quy logistic được đánh giá thông qua chỉ số R2. Chỉ số R2 cao cho thấy mô hình tiên lượng tốt xác suất kháng clopidogrel của bệnh nhân.