Các dòng ngô HR8 chuyển gen gfp và pat đã đ−ợc chuyển ra đất trồng. Chúng tôi đã đánh giá biểu hiện của gen kháng thuốc diệt cỏ (pat) trong các cây
Hình 40. Dòng ngô GA35 chuyển gen hữu thụ trồng trong nhμ kính (1, 2); Bắp ngô chuyển gen GA35 (thế hệ R1) (3, 4);
1 2
chuyển gen bằng cách phun dung dịch Basta (250mg/l PPT) lên lá của các cây này ở giai đoạn 2-3 lá mới xuất hiện sau khi chuyển ra đất. Số lần phun 3 lần, cứ 2 ngày phun 1 lần.
Theo dõi khả năng sinh tr−ởng, phát triển và đánh giá biểu hiện bền vững của gen đã chuyển ở các dòng HR8 chuyển gen trồng trong nhà kính đ−ợc tóm tắt ở bảng 35.
Bảng 35. Theo dõi sinh tr−ởng vμ phát triển của các dòng HR8 chuyển gen trồng trong nhμ kính
Ký hiệu Kết quả phân tích PCR Mức độ kháng basta Khả năng ST&PT B6/HR8/1 + +++ tự thụ B6/HR8/8 - - biến dị B7/HR8/1 + ++ tự thụ B7/HR8/4 + + Có bắp muộn, x HR8 B7/HR8/11 + ++ Có bắp muộn, x HR8 B9/HR8/1 + + Cờ lép, không có phấn, x HR8 B9/HR8/3 + ++ tự thụ B11/HR8/1 + +++ tự thụ B11/HR8/2 + + Có bắp muộn, x HR8 B11/HR8/4 + ++ Cờ lép, không có phấn, x HR8 B12/HR8/5 + + Cờ lép, không có phấn, x HR8 B15/HR8/5 + - Có bắp muộn, x HR8 B15/HR8/6 + +++ Tự thụ (+++): mức độ kháng rất tốt (++): mức độ kháng trung bình (+): mức độ kháng yếu
1 2
3 4 5
Hình 41. Đánh giá biểu hiện bền vững của gen pat ở các dòng ngô HR8 chuyển gen trồng trong nhμ
kính. 1, 2. Biểu hiện kháng thuốc diệt cỏ của các dòng chuyển gen (3 ngμy vμ 6 ngμy sau khi phun dung dịch basta) 3. Lá của cây ngô không chuyển gen vμ cây chuyển gen sau khi xử lý dung dịch basta; 4,5,6. Các dòng ngô HR8 chuyển gen hữu thụ trồng trong đất (thế hệ R1 tự thụ); 7. Các dòng ngô lai giữa dòng mẹ HR8 bình th−ờng với dòng HR8 chuyển gen (thế hệ lai R1 ).
Mức độ biểu hiện của gen kháng thuốc diệt cỏ đã đ−ợc quan sát thấy rất khác nhau ở các dòng HR8 chuyển gen. Kết quả sau 7 ngày phun dung dịch basta, ở các cây đối chứng (cây tái sinh từ phôi non không đ−ợc bắn gen) và cây tái sinh không đ−ợc chuyển gen tất cả lá đều héo rũ, cây chết, các cây đ−ợc chuyển gen pat vẫn phát triển bình th−ờng (hình 41.1-41.2).
Chúng tôi đã nhận đ−ợc 10 dòng ngô HR8 có khả năng kháng thuốc diệt cỏ tốt, lá xanh, cây phát triển bình th−ờng và đã thu đ−ợc hạt thế hệ R1 (hình 42.5- 42.7).
Hầu hết các cây chuyển gen tái sinh khi chuyển ra trồng trong đất đều biểu hiện kiểu hình bình th−ờng. Một số cây tái sinh biểu hiện sự thay đổi về kiểu hình, nh− giảm chiều cao, xuất hiện nhiều bắp, hoặc hình thành bắp lẫn với cờ. Ngoài ra, trong một số tr−ờng hợp, hạt của các dòng chuyển gen nhận đ−ợc bằng cách thụ phấn chéo hoặc thụ phấn với cây trồng từ hạt của dòng mẹ không đ−ợc chuyển gen (hình 41.7).
3.4.6. Kết luận
• áp dụng quy trình biến nạp gen bằng súng bắn gen đã đ−ợc hoàn thiện, chúng tôi đã tạo đ−ợc 10 dòng ngô HR8 chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ. Các dòng chuyển gen này đã đ−ợc phân tích sự có mặt của các gen đã chuyển bằng các ph−ơng pháp sinh học phân tử. Biểu hiện bền vững của các gen gfp và pat đã đ−ợc đánh giá ở các dòng chuyển gen trồng trong nhà kính. Đã thu đ−ợc hạt thế hệ R1 của các dòng chuyển gen này.
• Sử dụng dòng ngô Việt Nam có khả năng tái sinh cao GA35 đã chọn tạo đ−ợc và quy trình biến nạp gen thông qua Agrobacterium đã đ−ợc thiết lập, chúng tôi đã tạo ra 6 dòng ngô GA35 chuyển gen bền vững mang gen nptII. Sự có mặt của các gen đã chuyển trong các dòng ngô GA35 chuyển gen này đã đ−ợc phân tích. Đã thu đ−ợc hạt thế hệ R1 của các dòng chuyển gen này.
Ch−ơng 4.
Tổng quát hoá vμ đánh giá kết quả thu đ−ợc
Trong thời gian 3 năm từ tháng 1/2002 đến hết tháng 12/2004 đề tài đã thu đ−ợc các kết quả sau: