Trên cơ sở các kết quả nghiên cứu ảnh h−ởng một số yếu tố chính đến biểu hiện gen tạm thời, chúng tôi đã xây dựng và hoàn thiện quy trình biến nạp gen vào ngô bằng súng bắn gen và thông qua vi khuẩn Agrobacterium. áp dụng các quy trình biến nạp này, chúng tôi đã thực hiện hàng loạt các thí nghiệm biến nạp và đã nhận đ−ợc các dòng ngô chuyển gen bền vững bằng cả hai ph−ơng pháp.
3.4.1. Vật liệu và ph−ơng pháp 3.4.1.1. Vật liệu 3.4.1.1. Vật liệu
Vật liệu thực vật
Vật liệu sử dụng trong các thí nghiệm là phôi đ−ợc tách từ các bắp non của dòng ngô nhập nội HR8 và dòng Việt Nam có khả năng tái sinh cao GA35.
Plasmid sử dụng cho biến nạp gen bằng súng bắn gen
• Plasmid pUB-GFP mang gen gfp mã hoá cho protein phát huỳnh quang màu xanh lục (green fluorescent protein), đ−ợc điều khiển bởi đoạn khởi động mạnh ubiquitin tách từ cây ngô.
• Plasmid p35PAT: mang gen chọn lọc pat mã hoá cho enzym phosphynothrycin transferase, đ−ợc điều khiển bởi đoạn khởi động CaMV35S (hình 29).
Chủng vi khuẩn và plasmid vector sử dụng cho các thí nghiệm biến nạp thông qua Agrobacterium
Chủng Agrobacterium ATHV mang vectơ pBINGUSINT mang gen chỉ thị
gus-intron mã hoá cho protein β-glucuronidase và gen chọn lọc nptII mã hoá cho
3.4. Phân tích cây chuyển gen
3.4.1. Vật liệu và ph−ơng pháp
3.4.2. Kết quả đánh giá biểu hiện bền vững của gen chỉ thị trong các dòng ngô chuyển gen chuyển gen
3.4.3. Kết quả phân tích PCR các dòng ngô chuyển gen 3.4.4. Kết quả phântích lai Southern các dòng ngô chuyển gen 3.4.4. Kết quả phântích lai Southern các dòng ngô chuyển gen 3.4.5. Thử nghiệm cây chuyển gen trong nhà kính
enzym neophosphotransferase. Các trình tự mã hoá cho gen gus và nptII đã đ−ợc thêm đoạn khởi động CaMV35S và nos (hình 17.1).
3.4.1.2. Ph−ơng pháp
Tách ADN thực vật
Kiểm tra nồng độ ADN trên gel agarose 0,8% bằng cách so sánh với ADN lamda (ADN chuẩn).
Quan sát và đánh giá biểu hiện bền vững của gen gfp
Quan sát mô sẹo tạo thành từ phôi non sau khi chuyển gen/rễ các cây ngô chuyển gen gfp d−ới kính hiển vi huỳnh quang (MZFLIII/DC300F, Leica, Thuỵ Sỹ) ở độ phóng đại 2,5x, b−ớc sóng kích thích 480/40nm.
Đánh giá biểu hiện bền vững của gen gus bằng ph−ơng pháp thử với cơ
chất sinh màu
Chồi tái sinh từ phôi non đã chuyển gen gus, rễ cây ngô chuyển gen gus đ−ợc ngâm vào dung dịch X-gluc trong 24h ở nhiệt độ 37oC để quan sát sự thay đổi màu sắc của rễ.
Phân tích PCR các cây chuyển gen tái sinh
Hình 29. Sơ đồ cấu trúc plasmid p35PAT sử dụng cho các nghiên cứu chuyển gen vμo phôi ngô non bằng súng bắn gen
Xác định sự có mặt của các gen đã chuyển gfp/pat hoặc gus/nptII trong hệ gen thực vật bằng phản ứng PCR sử dụng các mồi đặc tr−ng (bảng 32). Phản ứng PCR đ−ợc tiến hành với thể tích phản ứng 25 μl, sử dụng Taq-ADN- polymerase (Q-Biogene, Đức) với 34 chu kỳ trên máy Peltier Thermal Cycler RTC-200.
Điện di sản phẩm khuyếch đại trên gel agarose (1%) ở 120 mV và nhuộm bằng ethidium bromide.
Bảng 32. Trình tự các đoạn mồi (Biozym) sử dụng trong nghiên cứu Đoạn mồi Trình tự GFP_T1 TTGGATCCCATGAGTAAAGGAGAAGA GFP_T2 GGTCTAGATTATTTGTATAGTTCATCC PAT_T3 CCTAACAGAACTCGCCGTAAA PAT_T4 TATAACAGCAACCACAGACTT NPTII_T5 GTGGAGAGGCTATTCGGGCCTA NPTII_T6 CCACCATGATATTCGGCAAG GUS_T7 GCAATTGCTGTGCCAGGCAGTTT GUS_T8 CCTGTAAGTGCGCTTGCTGAGTT VirD2A ATGCCCGATCGAGCTCAAGT VirD2C TCGTCTGGCTGACTTTCGTCATAA
Phân tích lai Southern
ADN tổng số đ−ợc chiết xuất từ lá non của cây ngô chuyển gen và cây không chuyển gen theo quy trình của Dellaporta & CS (1983) [43].
Enzym giới hạn SacI/HindIII đã đ−ợc sử dụng để cắt DNA của cây chuyển gen. Sau khi điện di trên gel agarose 0,8%, DNA đ−ợc chuyển lên màng Hybond-N+ (Amersham Pharmacia) và đ−ợc lai với mẫu dò (đã đ−ợc
đánh dấu phóng xạ α-32P-dCTP sử dụng bộ Kit Prime-It II Random
(Stratagene).
Thử nghiệm cây chuyển gen trong nhà kính
Các dòng ngô chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ (pat) tái sinh đã đ−ợc chuyển ra đất trồng. Sau 15-20 ngày xuất hiện 2-3 lá mới, tiến hành thử khả năng kháng thuốc diệt cỏ bằng cách phun dung dịch basta 250 mg/l (Bayer CropScience) và 0.1% (v/v) Tween 20. Phun đều lên lá của các cây đã đ−ợc chuyển gen và cây không đ−ợc chuyển gen (đối chứng), 2 ngày phun 1 lần, phun 3 lần.
Quan sát và theo dõi mức độ kháng thuốc diệt cỏ của các cây chuyển gen và đối chứng.
3.4.2. Kết quả đánh giá biểu hiện bền vững của gen chỉ thị trong các dòng ngô chuyển gen