Nhằm mục đích xây dựng và hoàn thiện quy trình chuyển gen vào ngô sử dụng súng bắn gen, chúng tôi đã tiến hành đánh giá biểu hiện tạm thời của gen gus
ở các phôi ngô non sau khi bắn gen 2 ngày trong tất cả các thí nghiệm. Những yếu tố chính ảnh h−ởng tới biểu hiện gen tạm thời và khả năng tái sinh của mẫu mô sau khi bắn, đó là: thời gian nuôi cấy phôi tr−ớc khi bắn, xử lý áp suất thẩm thấu tr−ớc và sau khi bắn và l−ợng hạt vàng sử dụng để đ−a ADN vào tế bào thực vật đã đ−ợc nghiên cứu và tối −u hoá.
3.2.1.3.1. ảnh h−ởng của thời gian tiền nuôi cấy phôi đến biểu hiện tạm thời của gen gus
Trong thí nghiệm đầu tiên này, chúng tôi sử dụng phôi non dòng HR8 có kích th−ớc khoảng 1-2mm (t−ơng ứng với tuổi phôi 18-20 ngày sau thụ phấn) tiền
nuôi cấy trong môi tr−ờng CN6 với khoảng thời gian khác nhau (0, 3, 5, 7 và 9 ngày) làm mô đích để bắn gen (hình 12).
Các thông số bắn áp dụng cho thí nghiệm nh− sau: plasmid ADN: pDB1; Khoảng cách từ mô đích tới màng nổ: 9cm; áp lực khí He:1350psi; Kích th−ớc hạt vàng: 1.0um; L−ợng hạt vàng: 1mg/6 đĩa bắn.
Kết quả bảng 17 cho thấy, sau 2 ngày bắn biểu hiện tạm thời của gen gus
quan sát đ−ợc t−ơng đối thấp ở các phôi non đ−ợc bắn gen ngay sau khi tách (đạt trung bình 5.2 đốm xanh/phôi bắn) (hình 13.a).
Bảng 17. ảnh h−ởng của thời gian tiền nuôi cấy phôi đến biểu hiện tạm thời của gen gus vμ khả năng tái sinh
Thời gian tiền nuôi cấy (ngày) Tổng số phôi bắn Tổng số đốm xanh/30 phôi bắn Số đốm xanh trung bình/phôi bắn Số phôi cấy chuyển Số phôi tạo EC Tỷ lệ tạo mô sẹo phôi hoá (%) 0 232 156±26,9 5,2±0,8 142 55 38,9±2,6 3 242 850±39,3 28,3±1,3 152 86 56,8±3,7 5 232 1622±51,5 54,0±1,7 142 90 63,5±2,5 7 246 1020±90,3 34,0±3,0 156 92 59,2±3,5 9 225 752±66,8 25,0±2,2 135 70 51,8±4,2 Đối chứng - - - 50 43 86,0±2,8
Hình 12. Mô đích sử dụng cho bắn gen: 1. Phôi non mới tách; 2. phôi non tiền nuôi cấy trên môi tr−ờng CN6 3 ngμy; 3. phôi non tiền nuôi cấy trên môi tr−ờng CN6 5 ngμy.
Hoạt tính gen gus tăng đáng kể ở những phôi đ−ợc tiền nuôi cấy trên môi tr−ờng tạo mô sẹo (dao động từ 25,0-54,0 đốm xanh/phôi bắn), tuy nhiên tần số này đã giảm dần ở những phôi đ−ợc nuôi cấy 7-9 ngày tr−ớc khi bắn gen (hình 13.d). Hoạt tính gen gus đạt giá trị cao nhất khi phôi non đ−ợc tiền nuôi cấy 5 ngày (đạt 54.0 đốm xanh/phôi bắn) (hình 13.c).
Xét về khả năng tạo mô sẹo phôi hoá của phôi non sau khi bắn: tần số tạo mô sẹo phôi hoá thu đ−ợc rất thấp ở các phôi đ−ợc bắn gen ngay sau khi tách (đạt 38.9%) (hình 14.2) so với các phôi đ−ợc tiền nuôi cấy trong môi tr−ờng tạo mô sẹo tr−ớc khi bắn (dao động từ 51.8-63.5%).
Tỷ lệ tạo mô sẹo phôi hoá đạt đ−ợc cao nhất ở các phôi non tiền nuôi cấy 5 ngày tr−ớc khi bắn (63.5%) (hình 14.3). Nghiên cứu của Brettschneider & CS (1997) [28] cũng cho thấy tần số chuyển gen và tái sinh cây thu đ−ợc cao hơn rõ rệt khi sử dụng phôi non tiền nuôi cấy trong môi tr−ờng tạo mô sẹo từ 2-6 ngày so với phôi bắn gen ngay sau khi tách.
Các nghiên cứu ở cây lúa mỳ cũng cho kết quả t−ơng tự. Sự tổn th−ơng của mô thực vật sau khi bắn giảm đáng kể khi phôi đ−ợc tiền nuôi cấy từ 2-7 ngày tr−ớc khi bắn (Zimny & CS, 1995) [121]. Vasil & CS, (1993) [111] khi bắn gen vào phôi
Hình 13. Biểu hiện gus tạm thời ở phôi bắn gen ngay sau khi tách(a); phôi tiền nuôi cấy 3 ngμy tr−ớc khi bắn gen (b); phôi tiền nuôi cấy 5 ngμy tr−ớc khi bắn gen (c); phôi tiền nuôi cấy 7 ngμy tr−ớc khi bắn gen (d);
lúa mỳ thấy rằng khả năng tái sinh cũng nh− hiệu quả chuyển gen tăng đáng kể khi phôi non đ−ợc tiền nuôi cấy ít nhất 7 ngày.
Trên cơ sở kết quả thu đ−ợc, phôi non tiền nuôi cấy 5 ngày trên môi tr−ờng tạo mô sẹo đ−ợc chúng tôi sử dụng làm mô đích cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.1.3.2. ảnh h−ởng khoảng cách bắn và áp lực khí He đến biểu hiện tạm thời của gen gus
Để nghiên cứu ảnh h−ởng của khoảng cách bắn và áp lực khí He đến biểu hiện gen tạm thời, phôi non tiền nuôi cấy trong môi tr−ờng CN6, thời gian 5 ngày đ−ợc sử dụng làm mô đích. Các thông số của quá trình bắn đ−ợc thực hiện nh− sau: plasmid ADN: pDB1; Kích th−ớc hạt vàng: 1.0um; L−ợng hạt vàng: 1mg/6đĩa bắn; Khoảng cách từ mô đích tới màng nổ: 6, 9, 12 cm; áp lực khí He: 900,1350, 1550 và 1800psi. Hai ngày sau khi bắn, biểu hiện tạm thời của gen gus ở các phôi bắn quan sát đ−ợc ở bảng 18.
Số liệu bảng 18 cho thấy: Khoảng cách từ màng nổ tới mô đích có ảnh h−ởng rõ rệt tới tần số biểu hiện gen tạm thời: ở khoảng cách 12cm, số đốm xanh/phôi bắn
Hình 14. Tạo mô sẹo phôi hoá vμ tái sinh chồi từ phôi không bắn gen (1,4); từ phôi đ−ợc bắn gen ngay sau khi tách (2, 5); từ phôi tiền nuôi cấy 5 ngμy tr−ớc khi bắn gen (3, 6);
1 2 3
6 5
quan sát thấy rất ít và khác nhau không đáng kể ở các áp lực khí khác nhau (trung bình 8.5 đến 15 đốm xanh/phôi); ở khoảng cách bắn 6cm, biểu hiện gen tạm thời thu đ−ợc khá cao ở áp lực bắn 1350psi (20.8 đốm xanh/phôi). Đáng chú ý là tần số biểu hiện gen tạm thời đạt giá trị t−ơng đối cao khi bắn ở khoảng cách 9cm với tất cả các áp lực bắn. Biểu hiện gen tạm thời đạt giá trị cao nhất khi bắn ở khoảng cách 9cm với áp lực bắn 1350 psi (đạt 53.2đốm xanh/phôi). Nghiên cứu của Bohorova & CS (1999) [26] cũng cho thấy tần số chuyển gen thu đ−ợc khi bắn với áp lực khí 1350psi cao hơn nhiều so với bắn ở áp lực 900 psi.
Bảng 18. ảnh h−ởng của khoảng cách bắn vμ áp lực khí đến biểu hiện gen tạm thời Khoảng cách (cm)- áp lực khí He (psi) Tổng số phôi bắn Tổng số đốm xanh/30 phôi bắn Số đốm xanh trung bình/phôi bắn 6-900 239 536±30,3 17,8±1,0 9-900 237 846±34,2 28,2±1,1 12-900 246 256±26,9 8,5±0,9 6-1350 239 624±29,5 20,8±1,0 9-1350 238 1596±43,2 53,2±1,4 12-1350 242 290±32,2 9,6±1,1 6-1550 245 585±25,2 19,5±0,8 9-1550 234 1020±90,3 34,0±3,0 12-1550 246 293±27,9 9,7±0,9 6-1800 250 313±20,8 10,4±0,7 9-1800 241 557±40,0 18,5±1,3 12-1800 232 452±47,6 15,0±1,6
3.2.1.3.3. Lựa chọn plasmid thích hợp cho biến nạp vào phôi ngô non bằng súng bắn gen
Trong quá trình chuyển gen thực vật thì cấu trúc của đoạn gen khởi động ảnh h−ởng rất lớn đến hiệu quả của quá trình chuyển gen cũng nh− biểu hiện của gen đã chuyển ở thực vật. Với mục đích lựa chọn đoạn gen khởi động thích hợp cho biến nạp gen vào phôi ngô bằng súng bắn gen, chúng tôi đã sử dụng các plasmid mang gen chỉ thị gus đ−ợc điều khiển bởi các đoạn khởi động khác nhau: plasmid pDB1
mang đoạn khởi động actin-1; plasmid pAHC25 mang đoạn khởi động ubiquitin và plasmid pSLGUS INT PAT mang đoạn khởi động CaMV 35S.
Các thông số bắn:
- Mô đích: phôi non tiền nuôi cấy trong môi tr−ờng CN6 thời gian 5 ngày.
- ADN plasmid: pDB1, pAHC25 và pSLGUS INT PAT.
- Khoảng cách từ mô đích tới màng nổ: 9 cm.
- áp lực bắn: 1350 psi.
- Kích th−ớc hạt vàng: 1.0um.
- L−ợng hạt vàng: 1mg/6 lần bắn.
Số liệu thu đ−ợc ở bảng 19 cho thấy biểu hiện tạm thời của gen gus tăng rõ rệt khi biến nạp phôi non dòng HR8 với plasmid pAHC25 mang đoạn khởi động ubiquitin đ−ợc tách từ cây ngô (đạt 65,6 đốm /phôi) (hình 15.2.).
Bảng 19. Biểu hiện gen tạm thời của phôi non dòng ngô HR8 sau khi bắn gen với các plasmid mang các đoạn khởi động khác nhau
Plasmid Tổng số phôi bắn Tổng số đốm xanh/30 phôi bắn Số đốm xanh trung bình/phôi bắn pDB1 246 1599,3±126,9 53,3±4,2 pAHC25 257 1968,3±66,6 65,6±2,2
pSLGUS INT PAT 238 960,3±60,0 32,0±2,0
Số đốm xanh xuất hiện trên những phôi non sau khi bắn với với plasmid pSLGUS INT PAT mang đoạn khởi động CaMV35S quan sát đ−ợc t−ơng đối thấp (32 đốm/phôi) (hình 15.1). Biểu hiện tạm thời của gen gus khác nhau không đáng kể khi biến nạp phôi non với plasmid pDB1 và pAHC25 mang đoạn khởi động actin-1 và ubiquitin (53,3 và 65,6 đốm/phôi t−ơng ứng). Kết quả nghiên cứu này cho thấy d−ờng nh− đoạn khởi động tách từ cây1 lá mầm sẽ có hiệu quả hơn trong quá trình biến nạp gen vào chính các loài một lá mầm.
Aulinger & CS (2002) [22] và Brettschneider & CS (1997) [28] cũng đã sử dụng các đoạn khởi động này để biến nạp gen vào ngô cho hiệu quả chuyển gen cao. Nghiên cứu bắn gen ở các cây một lá mầm khác của Gallo-Meagher & Irvine (1993) [54] cũng cho thấy hoạt tính gen gus tăng rõ rệt khi biến nạp mô lá non cây mía với cấu trúc gen đ−ợc điều khiển bởi đoạn khởi động ubiquitin so với các cấu trúc mang các đoạn khởi động khác nh−Emu, act1 và CaMV35S.
3.2.1.3.4. ảnh h−ởng của việc xử lý áp suất thẩm thấu đến hiệu quả chuyển gen tạm thời
Xử lý tế bào đích trong môi tr−ờng có các yếu tố tạo áp suất thẩm thấu hoặc xử lý thổi khô từng phần tế bào tr−ớc khi tiến hành các kỹ thuật chuyển gen đã nâng cao hiệu quả biểu hiện gen tạm thời cũng nh− tần số chuyển gen bền vững (Becker & CS, 1994; Vain & CS, 1993) [23], [107]. Trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng phôi non dòng HR8 tiền nuôi cấy trong môi tr−ờng CN6 thời gian 5 ngày làm mô đích. Mô đích đã đ−ợc xử lý trong môi tr−ờng OsM có bổ sung đ−ờng mannitol 0.2M và sorbitol 0.2M với khoảng thời gian khác nhau tr−ớc khi bắn (0; 5h) và sau khi bắn (0; 20h).
Các thông số bắn nh− sau:
- Plasmid: pDB1.
- Khoảng cách từ mô đích tới màng nổ: 9 cm.
- áp lực bắn: 1350psi.
Hình 15. Biểu hiện gus tạm thời ở phôi ngô non sau khi biến nạp với plasmid mang đoạn khởi động CaMV35S (1) vμ ubiquitin (2);
- Kích th−ớc hạt vàng: 1.0um.
- L−ợng hạt vàng: 1mg/6 lần bắn. Kết quả thu đ−ợc ở bảng 20.
Bảng 20. ảnh h−ởng của xử lý áp suất thẩm thấu đến biểu hiện gen tạm thời Thời gian xử lý (h) Tổng số phôi bắn Tổng số đốm xanh/30 phôi bắn Số đốm xanh trung bình/phôi bắn Mức độ biểu hiện của gen gus
Số phôi cấy chuyển Số phôi tạo EC Tỷ lệ tạo mô sẹo phôi hoá (%) 0-0 217 1632±34,4 54,4±1,1 Đốm xanh rộng, loang rộng ra xung quanh 127 78 61,4±5,8 5h - 0h 241 2149±87,8 71,6±2,9 151 106 70,2±6,2 5h - 20h 296 3402±93,9 113,4±3,1 Đốm xanh đậm, riêng rẽ 206 165 80,1±5,6 0-20 269 2067±67,3 68,9±2,2 179 117 65,3±7,6 Đối chứng - - - - 74 65 87,8±3,6 Số liệu bảng 20 cho thấy việc xử lý áp suất thẩm thấu tế bào mô đích tr−ớc và sau khi bắn gen đã có ảnh h−ởng rõ rệt đến biểu hiện tạm thời của gen gus: Biểu hiện tạm thời của gen gus đạt 68,9-113,4 đốm xanh/phôi, cao hơn nhiều so với phôi bắn không đ−ợc xử lý. Đáng chú ý là số đốm xanh quan sát đ−ợc nhiều nhất trên những phôi đ−ợc xử lý áp suất thẩm thấu 5h tr−ớc và 20h sau khi bắn gen, tăng gấp 3 lần (đạt 113.4 đốm xanh/phôi) so với phôi bắn gen không đ−ợc xử lý (54,4 đốm/phôi).
Nghiên cứu của Brettschneider & CS (1997) [28] khi bắn gen vào dòng ngô H99 cũng đã thu đ−ợc tần số biểu hiện gen tạm thời tăng gấp 5 lần ở những phôi non đ−ợc xử lý áp suất thẩm thấu trong môi tr−ờng có hàm l−ợng sucrose cao (0.6M). ảnh h−ởng tích cực của việc xử lý áp suất thẩm thấu có thể đ−ợc giải thích rằng d−ới tác dụng của nồng độ đ−ờng cao trong môi tr−ờng nuôi cấy đã làm co tế bào chất của tế bào thực vật, dẫn tới làm giảm sự tổn th−ơng của tế bào khi bị các phần tử vàng xuyên qua trong quá trình bắn gen (Vain & CS, 1993) [107].
Hơn nữa, kết quả thí nghiệm của chúng tôi cũng cho thấy xử lý áp suất thẩm thấu mô đích không chỉ ảnh h−ởng đến tần số biểu hiện gen tạm thời mà còn tác động đến mức độ biểu hiện của gen gus. Các đốm xanh rất đậm, riêng rẽ đã quan
sát thấy trên những phôi đ−ợc xử lý áp suất thẩm thấu tr−ớc và sau khi bắn (hình 16.B), trong khi đó ở những phôi không xử lý xuất hiện các đám xanh nhạt, loang rộng ra (hình 16.A).
3.2.1.3.5. ảnh h−ởng hàm l−ợng hạt vàng đến biểu hiện tạm thời của gen gus và khả năng tái sinh của phôi sau khi bắn gen
Hạt vàng có kích cỡ 1,0um với hàm l−ợng hạt vàng/đĩa bắn khác nhau (từ 20ug – 160ug) đ−ợc sử dụng trong nghiên cứu này. Kết quả thu đ−ợc ở bảng 21.
Bảng 21. ảnh h−ởng hμm l−ợng hạt vμng đến biểu hiện tạm thời của gen gus vμ khả năng tái sinh
L−ợng hạt vàng/đĩa bắn Tổng số phôi bắn Tổng số đốm xanh/30 phôi bắn Số đốm xanh trung bình/phôi bắn Số phôi cấy chuyển Số phôi tạo EC Tỷ lệ tạo EC (%) 160ug 244 1740±45,1 58,0±1,5 154 96 62,3±6,9 80ug 251 1679±30,0 56,0±1,0 161 116 72,0±4,9 40ug 292 1576±30,8 52,5±1,0 202 136 67,3±5,7 20ug 221 1496±80,0 49,9±2,7 131 79 60,3±6,0 Đối chứng 74 65 87,8±4,9 A B
Hình 16. Biêủ hiện tạm thời của gen gus ở phôi non dòng HR8 sau 2 ngμy bắn gen: A. Mô đích không xử lý áp suất thẩm thấu; B. Mô đích đ−ợc xử lý áp suất thẩm thấu 5h tr−ớc vμ
Số liệu bảng 21 cho thấy biểu hiện tạm thời của gen gus tăng cùng với sự tăng của hàm l−ợng vàng (tăng từ 49,9 đốm xanh/phôi tới 58 đốm xanh/phôi khi l−ợng hạt vàng tăng từ 20ug tới 160ug), tuy nhiên tác động này không rõ rệt. Khả năng tạo mô sẹo của phôi sau khi bắn gen thấp hơn nhiều so với đối chứng (phôi tái sinh không bắn gen) và đã giảm rõ rệt khi bắn với l−ợng hạt vàng cao 160ug/đĩa, tần số tạo mô sẹo đạt giá trị cao nhất khi bắn với hàm l−ợng 80ug/đĩa.
Brettschneider & CS (1997) [28] khi bắn gen vào phôi non dòng ngô H99 với l−ợng hạt vàng khác nhau cho thấy số phôi sau khi bắn có khả năng tạo mô sẹo phôi hoá tăng đáng kể khi giảm hàm l−ợng hạt vàng. Khả năng tái sinh của mẫu mô sau khi bắn gen tăng sẽ dẫn đến làm tăng tần số chuyển gen bền vững.
Nghiên cứu của Becker & CS (1994) [23] khi bắn gen vào phôi lúa mỳ cũng thu đ−ợc tần số tái sinh của phôi bắn t−ơng tự với phôi không đ−ợc bắn gen khi giảm hàm l−ợng hạt vàng.
3.2.1.3.6. ảnh h−ởng kích th−ớc hạt vàng đến biểu hiện tạm thời của gen gus và khả năng tái sinh
Trên cơ sở kết quả thu đ−ợc của các thí nghiệm tr−ớc, chúng tôi tiến hành thí nghiệm biến nạp sử dụng hạt vàng có kích cỡ khác nhau (1,0 um và 0,6um) với hàm l−ợng 80ug/đĩa bắn. Phôi ngô non tiền nuôi cấy trên môi tr−ờng tạo mô sẹo sau 5 ngày đ−ợc sử dụng làm mô đích.
Bảng 22. ảnh h−ởng kích th−ớc hạt vμng đến biểu hiện tạm thời của gen gus vμ khả năng tái sinh
Kích th−ớc hạt vàng Tổng số phôi bắn Số đốm xanh trung bình/30 phôi bắn Số đốm xanh trung bình/phôi bắn Số phôi cấy chuyển Số mô sẹo phôi hoá tạo thành Tỷ lệ tạo mô sẹo phôi hoá
(%)
1,0um 248 1641±38,8 54,7±1,2 158 112 71,4±8,8 0,6um 262 1824±38,1 60,8±1,2 172 143 83,4±2,9
Đối chứng - - - 64 56 88,0±6,8
Số liệu thu đ−ợc ở bảng 22 cho thấy biểu hiện tạm thời của gen gus tăng thể hiện bởi số đốm xanh trung bình xuất hiện trên những phôi non sau khi bắn với các hạt vàng có kích cỡ 0,6um, đạt 60,8 đốm/phôi. Tuy nhiên, hoạt tính gen gus thay
đổi không đáng kể khi bắn gen với các hạt vàng có kích cỡ lớn hơn (1,0um) (54,7 đốm xanh/phôi). Nghiên cứu của Frame & CS (2000) [52] khi bắn gen vào mô sẹo dạng II cho thấy biểu hiện gus tạm thời tăng 3 lần khi bắn với hạt vàng có kích cỡ nhỏ (0.6um) so với hạt vàng 1,0um.
Xét về khả năng tái sinh, mẫu sau khi bắn với các hạt vàng có kích cỡ 1,0um có tần số tạo mô sẹo (đạt71,4%) thấp hơn nhiều so với mẫu mô đ−ợc bắn với hạt vàng nhỏ hơn (0,6um) (83,4%). Randolph-Anderson & CS (1995) [84] khi sử dụng mô sẹo dạng I làm mô đích để bắn gen với các hạt vàng có kích th−ớc 0,6um và